加味六味地黄汤对UUO大鼠肾组织TGF-β1及EMT的影响＊

黄仁发，梁群卿，吴金玉，向少伟，龙 韵，康 雷

(1.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011;2.广西中医药大学第一附属医院肾内科，南宁 530023;3.北京中医药大学东直门医院门诊办公室，北京 100700)

目前认为，肾小管上皮-间质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)形成最重要的病理过程［1］。我们的前期临床研究表明，六味地黄汤及其怡肾汤(六味地黄汤加桂枝、荆芥、大黄)能改善5/6肾切除大鼠肾脏病理，减少CKD患者的蛋白尿，改善肾功能，降低血清纤维连接蛋白、IV型胶原纤维等致纤维因子，改善CKD患者的免疫功能，抑制微炎症状态，有较好的抗肾纤维化作用［2～6］。但加味六味地黄抗肾纤维化的信号机制尚未完全清楚。本研究中，我们探讨该方对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)及EMT 的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10～12周龄健康雄性清洁级 SD(Sprasue-Dawley)大鼠，体质量(210±34)g共45只，购自上海斯莱克景达实验动物有限公司(动物合格证号SCXK(湘)2009-0004)，在广西中医药大学实验动物学部饲养，在室温18～25℃、相对湿度50% ～60%、人工12 h昼/夜循环照明环境中用全价营养、分笼饲养。每日定时清洗笼舍，大鼠能自由摄食及饮水。

1.2 主要仪器和试剂

BX-50生物光学显微镜、水平电泳槽、TGF-β1多克隆抗体(santa cruz，sc-146)、α-SMA多克隆抗体(santa cruz，sc-58670)、E-Cadherin 多克隆 抗 体(santa cruz，sc-31020)、SP 免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、蛋白提取试剂盒(上海申能博彩生物技术公司)、BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术公司、PMSF(江苏碧云天生物技术公司)、PDVF膜(苏州广惠科技有限公司)。

1.3 加味六味地黄汤组成及制备

加味六味地黄汤组成:熟地黄10 g，山茱萸10 g，干山药 15 g，泽泻 10 g，茯苓 12 g，丹皮 10 g，大黄10 g，桂枝 10 g，丹参 15 g，黄芪 30 g，以上药物共132 g，均购自广西中医药大学附属瑞康医院药剂科。先将药材用相当于药材5倍的自来水浸泡2 h，煮沸后再微火煎煮30 min，过滤后收集煎液，原药渣加少量水煎煮得二煎液。两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩至浓度为每毫升药液含生药1 g。

1.4 单侧输尿管结扎大鼠模型的建立

大鼠适应性饲养1周后，10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后将大鼠俯卧位固定于大鼠固定板上，鼠背部左肋下备皮，常规消毒，沿腋后线从左肋下向尾部方向剪开皮肤，钝性分离皮下肌层和组织，暴露左肾，沿肾蒂向肾下极方向寻找输尿管，在输尿管上段行双线(4号丝线)结扎，两结扎点间剪断输尿管，逐层缝合皮下组织和皮肤，假手术组除不结扎输尿管外其他手术步骤均相同。

1.5 分组给药

健康成年SD大鼠90只，按体质量随机分为假手术组(n=30)、模型组(n=30)、中药组(n=30)，3组组内再分为7 d、14 d、28 d 3个时间点，每个时间点处死10只大鼠，假手术组和模型组每日给予生理盐水(2 ml/只/d)灌胃;中药组在造模后按上法制备加味六味地黄汤药液(2 ml/只/d)灌胃;留取各组大鼠血液及左肾组织检测相关指标。

1.6 指标检测

1.6.1 肾功能检测 收集血液，自动生化仪检测肾功能尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平。

1.6.2 肾脏病理检测 取左侧1/2肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中，将标本按顺序脱水、石蜡包埋、切片、行HE染色和Masson染色，于光学显微镜下观察肾间质改变并摄像。按以下方法进行评估［7］:首先计算30个高倍视野(×400)肾皮质中发生损害(肾小管扩张、萎缩、管型、坏死或小管炎)的肾小管数目和总肾小管数，以损害的肾小管数占总肾小管数的百分比表示。肾间质纤维化程度进行半定量评估，分值为0～4分，0分为正常;1分为肾间质纤维化面积不超过视野25%;2分为25%～49%;3分为50%～75%;4分为超过75%。计算30个肾皮质高倍视野(×400)，求和、取平均数，得该标本肾间质纤维化分值。

1.6.2 免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织α-SMA、E-Cadherin蛋白的表达 切片常规脱蜡至水，3%H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，0.01M枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原，羊血清工作液封闭，分别滴加α-SMA多克隆抗体(1∶150)、E-Cadherin多克隆抗体(1∶150)，37℃ 孵育 30 min，4℃ 过夜。DAB显色5～20 min，显微镜下观察大鼠肾组织蛋白表达的量及部位，肾小管上皮细胞胞浆有棕黄色颗粒为阳性，不着色者为阴性。每个标本随机选取10个皮质及外髓不重叠高倍(200×)视野计算细胞阳性率。细胞阳性率=阳性细胞数/视野所有细胞数×100%，取平均值作为每只实验大鼠的检测值，然后通过统计学方法进行半定量分析。

1.6.3 Western blot法检测各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白的表达 取保存的肾组织50～100 mg在冰上剪成碎片，加入蛋白裂解液提取组织总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。按Western blot步骤进行电泳、转膜，进行 TGF-β1 多克隆抗体(1∶300)、β-actin多克隆抗体(1∶300)的免疫检测，蛋白条带用IPP图像分析软件检测其OD值，用β-actin蛋白作为内参照，通过计算比值(OD目的蛋白/ODβ-actin)即目的蛋白的表达量来分析TGF-β1蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 加味六味地黄汤对大鼠肾功能BUN和Scr水平的影响

表1显示，假手术组BUN和Scr水平正常，而模型组大鼠第7天开始出现BUN和Scr水平增高，之后逐渐升高，至28 d达到高峰。与假手术组同时间点比较，模型组大鼠BUN和Scr水平增高，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相同时间点比较，中药组大鼠BUN和Scr水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 加味六味地黄汤对大鼠肾脏病理的影响

图1、2和表1显示，假手术组大鼠肾小管间质基本正常。而模型组大鼠第7天开始出现肾小管萎缩、间质纤维化，之后病变逐渐加重，至28天肾小管萎缩、间质纤维化达高峰。而经加味六味地黄汤干预后，肾小管萎缩、间质纤维化等病变明显改善。半定量评分结果表明，与假手术组相同时间点比较，模型组大鼠计分明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相同时间点比较，中药组大鼠肾小管间质评分降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 加味六味地黄汤对大鼠肾功能BUN和Scr水平的影响(±s，mg/dl)

表1 加味六味地黄汤对大鼠肾功能BUN和Scr水平的影响(±s，mg/dl)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较:△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组 别 例数Scr时间点BUN 10 7 d 14 d 28 d 7 d 14 d 28 d假 手 术 组 10 12.15± 4.24 11.96±3.98 12.07± 4.32 0.38±0.08 0.40±0.10 0.42±0.13模 型 组 10 42.56 ±10.64＊＊ 46.96 ±9.36＊＊ 48.67 ±10.25＊＊ 2.21 ±0.68＊＊ 2.76 ±0.36＊＊ 3.52 ±0.47＊＊中 药 组 10 34.87± 8.72△ 38.21±6.63△ 39.31±10.86△ 1.60±0.45△ 2.10±0.58△ 2.83±0.69△

图1 HE染色(×400)

图2 Masson染色(×400)

表2 各组大鼠肾小管间质半定量评分比较(±s)

表2 各组大鼠肾小管间质半定量评分比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组 别 例数7 d 14 d 28 d假手术组10 0.12±0.04 0.13±0.05 0.11±0.03模 型 组 10 1.87 ±0.68＊＊ 2.62 ±1.12＊＊ 4.12 ±1.64＊＊中 药 组 10 1.28±0.52△ 1.95±0.68△ 3.31±1.84△

2.3 加味六味地黄汤对大鼠肾脏E-Cadherin、α-SMA蛋白的影响

假手术组大鼠肾小管可见较多的E-Cadherin阳性蛋白表达，极少量的α-SMA阳性蛋白表达;模型组大鼠第7天即可见到较多的α-SMA阳性蛋白表达，而E-Cadherin阳性蛋白表达减少，随时间延长α-SMA阳性蛋白表达增多，E-Cadherin阳性蛋白表达下调，至第 28天 α-SMA蛋白达高峰，而 ECadherin阳性蛋白最少，与假手术组相同时间点α-SMA和E-Cadherin蛋白表达比较，模型组表达差异均有统计学意义(P＜0.01)。经加味六味地黄汤治疗后，肾小管α-SMA阳性蛋白表达下调，E-Cadherin阳性蛋白上调，与模型组相同时间点比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

图3 各组大鼠肾组织α-SMA蛋白表达(免疫组化×200)

表3 各组大鼠肾小管α-SMA蛋白阳性细胞数表达(±s)

表3 各组大鼠肾小管α-SMA蛋白阳性细胞数表达(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组 别 例数7 d 14 d 28 d假手术组10 8.72±2.06 9.18± 1.96 8.95± 2.14模 型 组 10 17.26±6.24＊＊ 28.58±10.36＊＊ 38.71±13.25＊＊中 药 组 10 11.47±4.82△ 19.67±8.74△ 31.35±7.96△

图4 各组大鼠肾组织E-Cadherin蛋白表达(免疫组化×200)

表4 各组大鼠肾小管E-Cadherin蛋白阳性细胞数表达(±s)

表4 各组大鼠肾小管E-Cadherin蛋白阳性细胞数表达(±s)

注:与假手术组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较:△P ＜0.05

组 别 例数7 d 14 d 28 d假手术组10 39.45±15.78 38.21±14.57 38.36±12.05模 型 组 10 30.17±14.22＊＊ 26.64±12.18＊＊ 21.35±12.56＊＊中 药 组 10 36.21±10.45△ 32.39±13.66△ 28.47±10.81△

2.4 加味六味地黄汤对大鼠肾脏TGF-β1蛋白表达的影响

假手术组大鼠肾小管可见少量的 TGF-β1蛋白表达;模型组大鼠第7天即可见到较多的TGFβ蛋白表达，随时间延长二者表达增多，至第28天达高峰，与假手术组相同时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。经加味六味地黄汤治疗后，肾组织TGF-β1蛋白表达下调，与模型组相同时间点比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图5 各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达(western blot)

3 讨论

RIF是导致肾功能丧失最主要的病理生理过程之一。RIF形成分子机制复杂，目前认为肾小管上皮-间质细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是 RIF形成最重要的病理过程［1］。EMT形成的标志是肾小管上皮细胞失去其上皮细胞表型E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)，获得MyoF表型如 α-平滑肌动蛋白(α-SMA)［1］，后者通过破坏的肾小管基底膜转位至肾间质，分泌III型胶原、IV型胶原等细胞外基质增多，从而引起RIF［8］。近年来，已有大量的实验研究证实，TGF-β1在RIF时EMT过程中起到重要的作用，被认为是最关键的致纤维化因子之一［8］。而抑制TGF-β1介导的EMT过程是减轻纤维化的重要手段。

表5 各组大鼠肾组织TGF-β1蛋白的表达(－x ± s，OD 目的/OD 内参)

中医理论虽无“肾纤维化”一词，但各种CKD最终可因久病伤正而导致正虚邪实、浊邪上逆，最终发展至水肿、癃闭、关格。在RIF的发生发展过程中，其本虚标实的病机特点已为大多数医家所认可，正不胜邪，“虚、瘀、湿、毒”是重要的四大病理因素，其中“虚”是RIF的根本，肾虚在RIF的整个病程中起至关重要的作用［10］。而“湿”、“瘀”是 RIF的病理基础，“毒”则是 RIF发展后期不可忽视的因素［11］。瘀血浊毒贯穿于纤维化整个病变过程中，是引起肾纤维化的主要因素［10］。因此，我们将中医药抑制RIF、延缓肾衰竭进程的切入点应放在补脾肾、祛湿、活血化瘀及排毒上。

六味地黄丸出自宋·钱乙《小儿药证直诀》，结合RIF时“虚、瘀、湿、毒”的四大病理因素及单味药研究结果，我们在六味地黄汤基础上加桂枝、大黄、黄芪、丹参，取桂枝通阳利水湿，大黄通便以排毒，黄芪益气健脾利水，丹参活血化瘀，取名加味六味地黄汤，全方共奏补益脾肾、利水活血、排毒的功能。本实验主要探讨六味地黄汤加味是否通过阻断TGF-β1的活化、抑制EMT过程，从而发挥延缓RIF的发生发展的作用。

我们的结果表明，加味六味地黄汤可改善肾小管间质病变及肾功能，提示具有较好的肾保护作用。进一步研究显示，随着RIF的程度加重，UUO大鼠肾小管 TGF-β1和 α-SMA表达增多，而 E-Cadherin蛋白表达减少，证实RIF过程中存在TGF-β1介导的EMT过程。而加味六味地黄汤可以下调肾小管TGF-β1和α-SMA的表达，上调E-Cadherin蛋白的表达，提示加味六味地黄汤抗RIF的机制可能与抑制TGF-β1介导的EMT过程有关，但加味六味地黄汤抗RIF的其他机制有待进一步研究。

［1］Strutz FM.EMT and proteinuria as progression factors［J］.Kidney Int，2009，75:475-481.

［2］陈北阳，何泽云，龙若庭，等.怡肾汤对大鼠5/6肾切除术后残肾肾功能及组织形态学的影响［J］.湖南中医学院学报，2005，25(3):11-13.

［3］黄仁发，史伟，吴金玉.怡肾汤治疗慢性肾衰竭的疗效观察及对免疫功能的影响［J］.湖南中医药大学学报，2007，27(6):52-54.

［4］黄仁发，隆献，吴金玉.怡肾汤对3～4期CKD患者血清LN、CV-Ⅳ和SOD、MDA的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10(5):421-422.

［5］康雷，黄仁发，向少伟.加味六味地黄汤对3～4期慢性肾脏病患者微炎症状态的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2011，10(12):1354-1359

［6］何泽云.六味地黄丸对5/6肾切除大鼠残肾肾小球化生的影响［J］.湖南中医学院学报，2004，24(2):1-3.

［7］杨椹，宁建平，曾莹晖，等.糖尿病大鼠肾小管整合素连接激酶的表达及氯沙坦的干预作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2007 ，8(4):199-201.

［8］Youhua Liu.New Insights into epithelial-mesenchymal transition in Kidney Fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21:212-222.

［9］Yin Z，Xia Y，Luo C，et al.Effects of Silencing Transforming Growth Factor-β1by RNA Interference Plasmid on Rat Renal Allograft Fibrosis Using Smads Pathway［J］.Urology，2011，77(3):762-767.

［10］卢祖礼，王小琴.浅析肾纤维化的中医病机［J］.湖北中医杂志，2004，26(11):18-19.

［11］郭小雷，陈敏，王怡.肾间质纤维化的中医阐述与探微［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12(4):243-245.