MCAO模型大鼠中医证候研究＊

吴相春，王少卿，唐 璐，朱文浩，高 颖

(北京中医药大学东直门医院神经内科，北京 100700)

缺血性中风严重威胁着人类健康，近年来我国缺血性中风发病率呈上升趋势，故其防治成为医学研究的重要课题。中医药在缺血性中风防治中发挥着重要作用，因此缺血性中风动物模型中医证候研究尤为必要。大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型是缺血性脑中风研究的常用模型。本研究探讨MCAO大鼠模型的中医证候，为中医药防治缺血性中风的辨证论治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康清洁级雄性SD大鼠70只，体质量在280～300 g，由北京华阜康生物科技有限公司提供(许可证号SCXK(京)2009-0007)。饲养于北京东直门医院中医脑病研究室动物房，光照12 h/d，温度20～23℃，相对湿度40% ～60%。正常饲料饮食，保持充足的饮水。

1.1.2 试剂 肾上腺皮质酮(cortisone，CORT)酶联免疫分析试剂盒，由北京北方生物技术研究所提供。MCAO线栓(A4级)由北京沙东生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 采用随机数字表法将70只SD雄性大鼠分为手术组、假手术组、正常对照组，其中假手术组和手术组按照3个时点分为3个亚组，即缺血6 h、48 h、72 h组，每个亚组10只。正常对照组10只。

1.2.2 模型制作 手术组动物采用大脑中动脉线栓法制备MCAO动物模型，参照Longa线栓法［1］的基础上加以改良，大鼠以3.5%的水合氯醛以1ml/100 g麻醉成功后仰卧固定，颈部正中切口1.5～2 cm，钝性分离肌肉，以开睑器暴露手术野，分离左侧颈总动脉(CCA)及伴行的迷走神经、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎CCA近心端，然后结扎ECA近心端，在距离CCA分叉处4 mm的血管壁上做一个小切口，轻轻插入线身直径0.26 mm、线头硅胶直径(0.36±0.02)mm的线栓，使其头端到达大脑中动脉起始处(从MCA至ECA分叉处约2 cm)，以抵触感为度，将CCA远心端结扎，剪掉线栓以及其他的线，在创面上点几滴青霉素液预防感染，缝合切口。术后3 h、6 h各评分1次，做好记录。假手术对照只是不插入线栓，其余步骤同手术组。缝合伤口，将术后大鼠置于电热毯保持体温。术后3 h采用Zea-longa［1］5级4分法标准进行神经功能缺损程度评分。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒;4分:不能自发行走，意识水平下降。以分值≥1分作为造模成功的入组标准。造插线操作超过15 min、术中出血多麻醉过深呼吸不规律、术后3 h仍不能苏醒的动物不列入统计范围。

1.2.3 大鼠一般情况监测 ①体质量:体质量变化分别在手术前、术后24 h、48 h、72 h进行体质量称量、记录;②模型动物精神、活动情况、皮毛、尾色、大便等。

1.2.4 神经功能Zea-Longa评分 分别在术后 3 h、6 h、24 h、48 h、72 h 进行神经功能 Zea-Longa评分，评分由两位实验人员共同观察记录，每只大鼠仅做1次神经功能Zea-Longa评分，实验要求在单盲的条件下进行。

1.2.5 放免法检测血清CORT 实验末，大鼠经麻醉后由腹主动脉取血3 ml加入空白试管中，4℃ 3000 r/min离心15 min，取上清置于-70℃冰箱中保存备用，放免法检测血清CORT含量，由北京康源瑞德生物科技有限公司严格按照试剂盒说明书要求进行检测。

1.2.6 脑组织形态学观察 大鼠经腹主动脉取血后夹闭腹主动脉，剪开胸部将灌注针由左心室穿入主动脉，依次注入0.9%生理盐水和4%多聚甲醛。灌注30 min后，取出脑固定于4%多聚甲醛中24 h，石蜡包埋。经HE染色，于光学显微镜下观察大鼠脑组织织形态学改变。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示，数据符合正态分布，多个样本均数比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(least significant difference，LSD)。如方差不齐或不符合正态分布，用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况

一般大鼠在手术完成后1.5～2 h苏醒，手术完成3 h后开始进行评分，可见大鼠偏瘫症状明显，表现为右侧肢体废用或力弱、前肢力弱、后肢拖拽，行走呈顺钟向追尾状，甚则向一侧倾倒;此外还可观察到，48 h、72 h手术组的大鼠在造模后24 h均出现左侧睑裂变小、左眼球肿胀并伴有分泌物，活动减少，身体蜷缩，体质量明显下降及肛周污染、稀便、舌质紫暗等症状，各时点假手术组动物均未出现神经功能缺损症状。

2.2 各组大鼠体质量变化

表1显示，与假手术组比较，术后24 h、48 h、72 h各时间点手术组大鼠体质量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 术后各时间点大鼠体质量变化比较(±s)

表1 术后各时间点大鼠体质量变化比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.01

组 别 例数 实验体质量 术后24 h 术后48 h 术后72 h假手术组10 239±8 236±10 244±12 236±11手 术 组 10 244±7 206± 7* 193±13* 186±11*

2.3 各组大鼠神经功能Zea-Longa评分变化

表2显示，与假手术组比较，各时间点手术组大鼠Zea-Longa神经功能评分均明显增高(P＜0.01)。

表2 术后各时间点大鼠神经功能Zea-Longa评分变化比较(±s)

表2 术后各时间点大鼠神经功能Zea-Longa评分变化比较(±s)

注:与假手术组比较:*P＜0.01

组 别 例数 术后3 h 术后6 h 术后24 h 术后48 h 术后72 h假手术组 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00手 术 组 10 2.46±0.78* 1.92±0.64* 1.15±0.38* 0.92±0.28* 1.00±0.00*

2.4 各组大鼠血清CORT水平变化

表3显示，与正常组比较，假手术6 h、48 h、72 h组血清CORT有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05);手术6 h、48 h、72 h组血清CORT明显升高，与48 h、72 h组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。与假手术组比较，手术48 h、72 h组血清CORT明显升高(P ＜0.05或P ＜0.01)。与手术6 h组比较，手术72 h组血清CORT明显升高(P ＜0.01)。

表3 各组大鼠CORT变化比较(±s，ng/ml)

表3 各组大鼠CORT变化比较(±s，ng/ml)

注:与正常组比较:*P ＜0.01;与假手术组比较:#P ＜0.05，##P ＜0.01;与6 h组比较:△P ＜0.01

组 别 例数6 h 48 h 72 h正常对照组10 48.91±11.59 48.91±11.59 48.91±11.59假 手 术 组 10 54.43±9.58 53.90±13.86 54.48±15.60手 术 组 10 57.11±13.69 66.61± 9.44*# 70.88±10.09*##△

2.5 各组大鼠脑组织形态学观察

正常组、假手术6 h、48 h组及假手术72 h组神经细胞形态完整，排列紧密，细胞核呈蓝紫色，胞浆呈粉红色，胞核完整，核仁清晰，细胞周围间隙无水肿，各时点均无炎性细胞浸润，也无梗死灶。缺血6 h组缺血侧大脑皮质神经元数量减少，结构破坏，排列紊乱，细胞体积大小不一，形态不规则，部分细胞空泡样变，胞核深染，核膜不清，核仁不明显，间质疏松，呈网状改变，血管周围间隙增宽。缺血48 h组缺血侧大脑皮质神经元缺血性损害加重，进一步变性坏死、溶解，间质更加疏松，空泡样变明显。缺血72 h组缺血侧大脑皮质神经元缺血性损害进一步加重，变性坏死、溶解，间质更加疏松，空泡样变明显。

图1 各组大鼠脑组织HE染色变化比较(400)

3 讨论

中医证候是机体生理病理整体反应状态的概括，四诊信息实际上就是证候的表征。动物证候表征研究具有较好的稳定性、可视性、可测性和可重复性［2］。MCAO大鼠模型是国内外研究缺血性中风的经典模型，改进后的线栓法简便、易重复，降低了动物死亡率，提高了成功率，复制的可逆性局灶性脑缺血模型是研究脑缺血再灌注损伤较为理想的模型［3］。在MCAO大鼠模型、双侧颈总动脉结扎大鼠模型、单侧颈总动脉结扎大鼠模型的3种脑缺血模型中，MCAO模型可能为最合适的诱发血瘀证生物表征的脑缺血模型［4］。本研究结果显示，MCAO大鼠模型呈现活动减少、蜷缩、精神萎靡、毛色枯槁、饮食减少、体质量明显下降、肛周污染、稀便、舌质紫暗等症状，造模初期可见偏瘫症状明显，表现为右侧肢体废用或力弱，行走呈顺钟向追尾状，甚则向一侧倾倒。MCAO大鼠模型临床表现符合肾虚血瘀证候标准［5］。

中医认为，“年四十而阴气自半，起居衰矣”，年老肾精不足，元气亏虚，脏腑功能衰弱，肢体活动迟缓，气血运行缓慢，血流不畅致脑脉瘀滞不通而发中风。正如《医林改错·王清任》曰:“半身不遂，亏损元气，是其本源。”《医学衷中参西录·张锡纯》亦云:“人之脑髓空者……甚或猝然昏厥，知觉运动俱废。”下丘脑-垂体-肾上腺轴是机体神经内分泌系统重要的组成部分。虽有报道显示与正常人比较，肾阳虚患者尿17羟皮质类固醇降低，而肾阴虚患者时高时低、变化不定［6］。但随着年龄的增长，血清皮质醇水平逐渐上升，高龄老年者更加明显［7］。神经-内分泌-免疫网络的功能失调将进一步加重脑缺血再灌注后的神经元损伤。脑缺血再灌注后2～24 h时间内，实验大鼠血浆的ACTH、CORT含量明显增高［8］。脑缺血后大鼠垂体体质量明显减轻，血浆CRH、ACTH和CORT浓度呈一致性先短暂升高后持续下降［9］。本研究结果显示，模型大鼠在缺血6 h时血清CORT增高，随着缺血时间的延长，血清CORT进一步增高，表明大鼠存在神经内分泌功能紊乱。

MCAO 30 min缺血侧基底结区首先出现大量的暗神经元和坏死，至MCAO 1 h这些改变逐渐扩展到皮层。如果组织持续缺血、坏死和暗神经元将在组织水肿期后急剧增多，这些改变并不因组织灌注的恢复而逆转［10］。本研究发现，模型大鼠脑组织形态学发生明显改变，在梗死侧皮层区神经元数量减少，结构破坏，排列紊乱，而缺血48 h组、72 h组缺血侧大脑皮质神经元变性坏死、溶解，间质更加疏松，空泡样变明显。

本研究从MCAO大鼠模型临床表征及生物学基础进行探讨，表明MCAO大鼠存在明显的肾虚血瘀证候，为中医药研究脑中风提供实验基础。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，21(20):84-91.

［2］林志健，张冰，刘小青，等.中医证候动物模型评价研究［J］.中华中医药杂志，2013，28(8):2217-2221.

［3］吴松笛，耿晓英.改良线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的实验研究［J］.陕西医学杂志，2006，35(10):1316-1318.

［4］李乐军，田金洲，尹军祥，等.不同脑缺血诱发血瘀证表征模型的研究［J］.北京中医药大学学报，2007，30(12):816-817.

［5］郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(试行)［S］.北京:中国医药科技出版社，2002:385-390.

［6］沈自尹，张丽丽，查良伦，等.肾阳虚病人的垂体-肾上腺皮质系统的改变［J］.上海中医药杂志，1979，2:34-37.

［7］林英，王卫东，叶山东，等.中老年男性下丘脑-垂体-肾上腺轴激素水平改变与生活质量关系的研究［J］.中国临床保健杂志，2013，16(2):136-138.

［8］魏翠柏，田金洲，唐一鹏，等.健脑安对MCAO模型大鼠HPA轴影响的实验研究［J］.中国医药学报，2004，19(5):310-311.

［9］陈爱娟，卓安山，杨秋佳，等.脑缺血再灌注对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的影响［J］.上海免疫学杂志，2002，22(4):269-272.

［10］何明利，陈曼娥，王景周.MCAO后鼠脑的病理演变及其治疗窗数学模拟研究［J］.中国现代医学杂志，2000，10(4):5-6，108-109.