天花粉蛋白介导入肺癌A549细胞Caspase-3表达及相关JNK信号通路的研究＊

庄 静，汪丛丛，吕庆亮，刘泽旺，秦宝宁，曹晓靖，孙长岗

(1.南京中医药大学研究生院，南京 210023;2.潍坊市中医院，山东潍坊 261041;3.潍坊医学院山东 潍坊 261000;4.山东中医药大学，济南 250355)

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从栝楼等葫芦科植物根块中提取的一种高分子蛋白质，广泛应用于临床治疗［1］。天花粉蛋白可有效地通过抑制肿瘤细胞凋亡，是目前恶性肿瘤治疗的一种全新治疗手段。因对正常组织毒副作用小、抗癌谱广、价格低廉，使其较传统化疗药物有显著优势，受到国内外学者的广泛关注［2］。本文旨在研究天花粉蛋白(TCS)对人肺腺癌A549细胞凋亡信号分子caspase-3表达的影响及其作用机制与JNK信号传导通路激活的相关性，从细胞和分子水平上揭示TCS诱导A549细胞凋亡的机理，为天花粉蛋白在今后肿瘤防治中的应用提供重要的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌A549细胞株购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司试剂部，天花粉蛋白(1.2 mg/ml)购自上海金山制药有限公司，丝裂霉素、链霉素(10 mg/支)由浙江海正药业公司生产，DMEM、新生胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)购自杭州四季青公司，RPMI-1640培养基(美国Promega公司)，碘化丙啶(PI)(美国 Sigma公司)，MTT(美国 Amresco公司)。SP600125(美国 Alexis公司)，鼠抗人β-actin抗体(美国 Sigma公司)，鼠抗人 JNK、鼠抗人caspase-3单抗及HRP标记的山羊抗鼠二抗(美国SANTA CRUZ公司)，PVDF膜(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人肺癌细胞株A549采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml，pH7.2)，常规37℃、5%CO2培养箱中静置培养。

1.2.2 MTT法测定TCS对人肺癌A549细胞增殖活性的影响 选取对数生长期的A549细胞，调整细胞悬液浓度为1.0×105/ml，每孔加入新鲜培养液100 μl，37℃孵育24 h。实验组分别加入不同浓度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，同时设置对照孔(1‰DMSO)，每孔再设3个复孔，继续培养24 h、48 h、72 h。培养结束后，吸除原培养液，每孔加入20 μL的 MTT溶液(5 μg/ml)作用4 h。再加入100 μL二甲基亚枫(DMSO)，摇床缓慢震荡15 min。设置A1为调零孔，用酶联免疫检测仪测定各孔在OD(570 nm)处的光密度值(即A值)。计算细胞生长抑制率(%)=(1－实验孔A值/对照组A值)×100%。

1.2.3 天花粉蛋白对肺癌A549细胞JNK信号通路的影响 取对数生长期A549细胞，各组分别加入不同浓度的 TCS 注射液(25、50、100 μg/ml)，常规培养48 h，调整细胞数为1×105/ml，每孔加入200 μl细胞悬液，且设3个复孔。加入细胞裂解缓冲液预处理，提取上清细胞总蛋白，分光光度法定量。再次离心取50 μg蛋白上样到12%SDS-聚丙烯酰胺预制胶分离，印迹转染醋酸纤维膜。用含5%脱脂干燥奶粉37℃封闭1 h。加入抗JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)抗体于4℃过夜。分别加入HRP标记的山羊抗鼠二抗37℃孵育1 h。加入ECL后冲洗、曝光，分析所显影条带的性质。

1.2.4 天花粉蛋白对人肺癌 A549细胞Caspase-3 mRNA的表达 取对数生长期A549细胞，随机分为对照组、SP组、25 μmol/mlTCS组以及TCS+SP组，处理细胞24 h，以5×105个/ml细胞浓度的肺癌A549细胞加入1 ml Trizol溶液，室温放置5 min，使细胞充分裂解。常温下离心，弃沉淀取上清液。按200 μl氯仿/ml Trizol的比例加入氯仿，震荡15 min，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。引物设计参照Premier 6.0设计(如表1)。按照RTPCR试剂盒操作说明，其产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。凝胶成像系统扫描分析电泳条带，计算相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，所有实验重复3次，数据结果以均数±标准差(±s)表示，完全随机分组实验所得数据的多组比较采用方差分析，成组分析采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结果

2.1 MTT法测定TCS对人肺癌A549细胞增殖的影响

为观察TCS对肺癌A549细胞生长的状况，采用 MTT 法分析 TCS 在 0、25、50、100 μg/ml浓度处理后A549细胞增殖情况。MTT法显示，TCS对人肺癌A549细胞株的生长抑制作用明显，且呈时间和剂量依赖性，各组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表2 TCS对A549细胞增殖抑制作用

2.2 TCS对肺癌 A549细胞JNK、p-JNK蛋白的表达

为观察TCS对肺癌A549细胞内JNK信号通路的影响，我们采用Western blot法分析在不同浓度TCS处理后细胞内JNK、p-JNK蛋白的表达情况。免疫印迹结果显示，随着天花粉蛋白浓度的升高，磷酸化JNK表达水平明显高于对照组(P＜0.05);而JNK表达水平与天花粉蛋白药物浓度无明显变化(P ＞0.05)。

2.3 JNK通路介导的天花粉蛋白诱导肺癌细胞Caspase-3 mRNA的表达

为观察JNK通路在 TCS对肺癌A549细胞caspase-3表达的作用，我们采用RT-PCR法分析由对照组、SP 组、25 μmol/mlTCS 组、50 μmol/mlTCS组以及TCS+SP组处理后，细胞内Caspase-3 mRNA的表达情况。RT-PCR显示，细胞内 Caspase-3 mRNA的表达量随TCS浓度增加呈上升趋势，2组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。预先加入JNK特异性抑制剂，Caspase-3表达量相较于对照组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1

图2 TCS干预肺癌A549细胞Caspase-3mRNA表达的影响

3 讨论

天花粉是我国传统中草药，为葫芦科植物栝楼的块根，因其粉洁白如雪，故名天花粉［3］。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是天花粉的有效成分。近年来研究发现，TCS具有多种药理学活性，主要包括免疫调节、抗肿瘤和抗人免疫缺陷病毒、引产等［4］。其生物学活性与其诱导凋亡、抑制增殖能力有关，且天花粉蛋白对肿瘤细胞具有比较明显的细胞选择毒性。以往对天花粉蛋白的抗肿瘤研究主要集中在结构、酶学功能、药理作用等方面，对其引起肿瘤细胞凋亡和信号传导的分子机制研究较少。因此，为更好地应用于临床，更多地为人们所认同，对天花粉蛋白抗肿瘤细胞作用的具体可能机制进行深入研究是非常有必要的。

Caspase-3是Caspase家族的最重要成员，是调控细胞凋亡的最终执行分子，在细胞凋亡的过程中发挥着不可替代的作用［5，6］。细胞凋亡过程中Caspase-3作为下游信号分子主要有以下两方面作用:一方面，其作为启动物，接受凋亡信号而发生细胞内的级联反应;另一方面，可作为效应物水解各种细胞成分从而形成凋亡小体［7］。Caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞的内部，只有经过水解加工成活性片段才可以发挥生物学活性。JNK信号通路是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路的一个重要分支［8］，也是细胞信号传导网络中最重要的传导通路之一，在调控细胞增殖分化、凋亡、应激及参与细胞骨架调节等多种生理和病理过程中起至关重要的作用。

据文献记载［9，10］，天花粉蛋白可以通过激活JNK信号通路，诱导肿瘤细胞内caspase-3蛋白的活化，是其抑制肿瘤生长的关键环节。本实验发现，TCS可明显抑制A549细胞增殖活性，且与浓度和作用时间呈正相关。TCS诱导细胞凋亡的过程中伴有JNK信号通路的激活。磷酸化JNK蛋白的表达水平相应增加，而JNK蛋白变化不显著。此外，细胞内Caspase-3 mRNA的表达量随TCS药物浓素增加呈上升趋势。选取JNK特异性抑制剂SP600125，SP组Caspase-3 mRNA表达量相较于对照组减少。结果提示，TCS诱导caspase-3 mRNA活化的同时可能与JNK信号通路的激活有关。caspase-3酶原的激活对于天花粉蛋白诱导的肿瘤细胞凋亡也是必不可缺的，JNK特异性抑制剂SP600125可有效地抑制细胞凋亡，在天花粉蛋白诱导肺癌A549细胞凋亡中，Caspase-3发挥了重要作用。

综上所述，本实验证实天花粉蛋白可以有效地抑制肺癌细胞的增殖，JNK信号通路的激活以及胞内caspase-3蛋白的表达是其抑制肿瘤细胞生长的关键环节。今后我们的实验需要进一步涉及其他参与调控分子的研究，以便从细胞和分子水平上揭示TCS诱导A549细胞凋亡的机理，为天花粉蛋白在肿瘤防治中的应用，提供重要的理论和实验依据。

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