特应性皮炎患者皮肤屏障与水闸蛋白1表达的相关性研究

袁超 钱春艳 杨丽洁 王学民

特应性皮炎患者皮肤屏障与水闸蛋白1表达的相关性研究

袁超 钱春艳 杨丽洁 王学民

目的研究特应性皮炎(AD)患者皮肤屏障功能情况,并分析其与水闸蛋白1(claudin-1)表达的相关性。方法纳入AD患者和健康人各11例。应用皮肤经表皮失水率测定仪和皮肤高频超声检测仪测定受试者经表皮失水率、表皮厚度与表皮致密度,并用双抗体夹心ELISA法定量检测血清中脱落claudin-1表达量。应用单因素方差分析和t检验比较不同组别之间相关参数的差异;应用Pearson相关系数分析不同参数之间的相关性。结果AD患者皮疹部位经表皮失水率为(36.9±34.2)g·m-2·h-1,非皮疹部位为(9.1±6.0)g·m-2·h-1,均高于健康对照[(4.4 ± 3.1)g·m-2·h-1];AD 患者皮疹部位表皮厚度(0.23 ± 0.04)mm,显著高于非皮疹部位[(0.18±0.03)mm]和健康对照[(0.18±0.02)mm]。AD患者皮疹部位有其特征性表皮下低回声带。AD患者claudin-1表达量为(0.80±0.88)ng/ml,显著低于健康人[(1.73±1.85)ng/ml];claudin-1与表皮厚度显著负相关(r=-0.61),与经表皮失水率的倒数显著正相关(r=0.44)。结论AD患者损伤的皮肤屏障功能与claudin-1表达相关,屏障功能状态可用经表皮失水率、经表皮失水率倒数和表皮厚度进行定量表述。

皮炎,特应性;皮肤屏障;Claudin-1;紧密连接蛋白质类

作者单位:200443上海市皮肤病医院皮肤与化妆品研究室

遗传性或获得性皮肤屏障功能障碍在特应性皮炎(AD)发病中起着重要作用[1]。皮肤物理性屏障主要包括两个重要结构:角质形成细胞和紧密连接(tight junction,简称TJ)[2]。TJ是物理屏障中一种细胞与细胞之间的连接结构,它是渗透性阻隔的有效成分,其结构完整性直接关系到皮肤屏障功能。水闸蛋白1(claudin-1)是TJ中跨膜蛋白之一,它与角质形成细胞共同维持皮肤屏障功能和栅栏功能[3]。早在2002年,Furuse等[4]就报道在claudin-1缺陷小鼠上,可观察到皮肤角质层形态学改变,且该小鼠在出生24 h内死亡,伴有严重缺水症状、经表皮失水率(TEWL)增高、皮肤黏合力降低。本研究的目的是探讨AD患者皮肤屏障功能的评价方法,claudin-1表达在AD患者和健康人之间的差异以及claudin-1与哪些非创伤检测参数相关等。

对象与方法

一、对象

按照Williams诊断标准,入选成人AD患者11例,上述患者均处于疾病缓解期(试验中将缓解期定义为近1周内无新发皮疹,之前皮疹尚可辨别)。AD组中,男7例,女4例,平均病程(11.1±9.7)年,年龄21～31岁,平均(26.3±3.6)岁;按同样年龄与性别,配比健康志愿者11例,AD组与对照组在年龄与性别比方面完全一致。该试验通过上海市皮肤病医院伦理委员会批准,每例受试者在试验前签署知情同意书。

二、材料与方法

1.仪器与试剂:皮肤经表皮失水率测定仪(Tewameter 210,德国Courage+Khazaka公司),皮肤高频超声检测仪(Ultrasonic UC22,德国Courage+Khazaka公司);ELX800吸收光酶标仪(美国伯腾仪器有限公司),claudin-1检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司),产品编号为E92388Hu 96T。

2.方法:

(1)AD患者皮疹严重程度评估:应用湿疹面积和严重度指数(eczema area and severity index,EASI)。具体方法:评估头颈部(10%)、上肢(20%)、躯干(30%)和下肢(40%)受累面积、红斑、丘疹、鳞屑、苔藓样变、瘙痒程度,每处评分计为0～3分,0分为无,1分为轻度,2分为中度,3分为重度。累加计算每例患者EASI总分分值。

(2)TEWL检测:应用TEWL测定仪分别测定患者3处不同皮疹处及其所对应的非皮疹处(皮疹周边正常皮肤处),并通过TEWL值计算1/TEWL值;同时检测健康对照相应部位皮肤。

(3)皮肤表皮厚度(ET)与致密度(ED)检测:应用皮肤高频超声检测仪对患者一处皮疹进行图像扫描,并通过其软件分析并测定ET与ED值;同时检测健康对照相应部位皮肤。

(4)血claudin-1含量测定:运用双抗体夹心ELISA法测定。抽取AD患者和健康人外周静脉血全血,分离血清,按照试剂盒说明书操作,读取A450值,据此计算claudin-1含量。

3.统计学方法:应用SPSS13.0软件包进行分析。单因素方差分析比较患者皮疹、非皮疹以及健康人之间TEWL、ET和ED差异。应用t检验比较AD患者和健康人之间血清脱落claudin-1的差异。应用Pearson相关系数分析各参数之间相关性。

结 果

一、一般情况

AD患者中,6例出现嗜酸性粒细胞百分率增高(＞正常值5%),9例出现IgE高于正常参考值(165 IU/ml),4例既往有哮喘病史,4例有过敏性鼻炎病史。患者湿疹面积和严重度指数的分值最高为44.1,最低为12.2。健康对照组,嗜酸性粒细胞百分率和IgE均在正常水平,且均无哮喘或过敏性鼻炎病史。

二、皮肤屏障功能评估情况

1.TEWL、ET、ED情况:见表1。AD患者皮疹处TEWL显著高于其非皮疹处(P＜0.05),而非皮疹处TEWL显著高于健康对照同一检测部位(P＜0.05)。AD患者皮疹处ET显著高于非皮疹处和健康对照(均P＜0.01),AD患者非皮疹处与健康人同一部位差异无统计学意义(P＞0.05)。AD患者皮疹处ED值与其对应的正常皮肤以及健康对照皮肤相比差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

2.AD患者皮疹处特征性改变:有明显的“表皮下低回声区域(sub-epidermal low echogenic band,SLEB)”,该SLEB宽度甚至大于其相应的表皮厚度,而在AD患者正常皮肤处及健康对照同一部位不存在该SLEB。见图1。

表1 AD患者和健康人皮肤TEWL、ET和ED值比较(±s)

表1 AD患者和健康人皮肤TEWL、ET和ED值比较(±s)

注:AD:特应性皮炎;TEWL:经表皮失水率;ET:表皮厚度;ED:表皮致密度;与AD皮疹处比较,a:P＜0.05;b:P＜0.01;与AD正常皮肤比较,c:P＜0.05

TEWL(g·m-2·h-1)ET(mm)ED(g/mm2)36.9±34.2 0.23±0.04 140.4±20.7 9.1±6.0a 0.18±0.03b 156.1±17.3 4.4±3.1ac 0.18±0.02b 152.5±16.0 8.356 9.795 2.292例数AD皮疹处 11 AD正常皮肤 11健康人皮肤 11 F值

三、claudin-1与皮肤屏障功能各参数之间的相关性分析

1.claudin-1在AD患者中表达量为(0.80±0.88)ng/ml,而健康人为(1.73±1.85)ng/ml,AD患者的表达量显著低于健康人(t=2.536,P＜0.05)。claudin-1与1/TEWL呈正相关(r为0.44,P＜0.05),与ET负相关(r为-0.61,P＜0.01),即角质层越厚,claudin-1表达越低;claudin-1与TEWL之间的r为-0.26,与ED的r为0.40,但差异均无统计学意义(均P＞0.05)。

皮肤屏障功能各参数之间相关情况为:TEWL与ET呈正相关(r为0.74,P＜0.01),与ED负相关(r为-0.46,P＜0.05);1/TEWL和ET负相关(r为-0.50,P＜0.05);而ET和ED负相关(r为-0.53,P＜0.05)。

图1 特应性皮炎患者和健康人不同部位皮肤高频超声图像比较 1a:AD患者皮疹部位可见明显表皮下低回声区域(箭头);1b:患者正常部位无明显表皮下低回声区域,可见表皮轻度变薄;1c:健康对照皮肤

讨 论

De Benedetto等应用免疫组化方法测定AD患者非皮疹部位TJ蛋白含量,发现claudin-1和claudin-23表达量均显著降低,同时还发现claudin-1单型体顶端的单核苷酸多态性[5]。这些都证实AD患者的确存在claudin-1缺陷,并进而导致皮肤屏障功能障碍。在银屑病患者的皮疹中,研究发现claudin-1和claudin-4在患者和正常人中没有差异,但claudin-5在颗粒层中出现异常表达[6]。新近对于“新生儿鱼鳞病硬化性胆管炎”(neonatal ichthyosis-sclerosing cholangitis)的报道,更说明claudin-1缺陷不但表现于皮肤组织,还可迁延至其他器官或组织,引起更为严重损害[7-8]。这些都证实,TJ蛋白与皮肤屏障功能之间存在紧密关联。

本研究中,TEWL测定法和皮肤高频B超检测法均可以通过相关的检测参数,对AD患者和健康人进行定量评估皮肤屏障功能。值得一提的是1/TEWL,早在1998年,Schwindt等[9]在胶带粘贴试验中应用到这个参数,发现该参数与表皮厚度有很好的负线性关系。后来Weigmann等[10]通过430 nm分光光度仪确认,1/TEWL与皮肤表面“累积角质形成细胞数”密切相关。Voegeli等[11]在AD患者的皮疹处与非皮疹处进行了该参数的验证,认为1/TEWL可以很好地表示皮肤厚度。在本研究中,我们发现:1/TEWL与表示表皮厚度的ET显著负相关,r达到-0.50,从另一个方面验证了之前的理论。claudin-1与TEWL相关性无统计学意义,而与1/TEWL显著正相关,与ET显著负相关,说明claudin-1的表达在增厚的角质层中是降低的,claudin-1如同黏合剂一样,将细胞与细胞连接在一起,而claudin-1与1/TEWL显著正相关,说明一定程度上,1/TEWL可以表示细胞之间的黏合力状况,1/TEWL越小,细胞间黏合力越差,这对于间接了解皮肤角质形成细胞间的黏合力情况,提供了一个非创伤性检测参数。

近年来,皮肤B超的无创性、操作简单和价格低廉优点使其在皮肤肿瘤、硬皮病、疤痕疙瘩、银屑病等皮肤疾病诊断与治疗判断上都显示出较好的应用价值[12-13]。本研究中,AD患者B超图像中直观看到了“表皮下低回声区域”,该区域形成可能与表皮下层炎性水肿及真皮上部血管扩张有一定关联;AD患者皮疹处表皮厚度增高,而致密度降低,这和表皮角化过度及角化不全密切相关。因此皮肤B超可在一定程度上反映出皮肤病的病理状态。claudin-1与表皮厚度显著负相关,而与致密度关系不明显,提示我们在应用致密度参数时,需要综合考虑皮肤的厚度情况。而TEWL参数与ET和ED参数的相关性均有统计学意义,说明这两个参数可作为皮肤屏障功能评价方法之一。

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2013-07-30)

(本文编辑:尚淑贤)

Relationship between skin barrier function and claudin-1 expression in patients with atopic dermatitis

Yuan Chao,Qian Chunyan,Yang Lijie,Wang Xuemin.Skin&Cosmetic Research Department,Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai 200443,China

Wang Xuemin,Email:dermxmwang@126.com

ObjectiveTo evaluate skin barrier function in patients with atopic dermatitis(AD),and to assess its relationship with claudin-1 expression.MethodsTotally,11 patients with AD and 11 healthy human controls were recruited in this study.A Tewameter TM210 was used to measure transepidermal water loss(TEWL)value,and high-frequency ultrasound to determine epidermal thickness and density,in lesional and non-lesional skin of the patients and normal skin of the healthy controls.A double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the serum level of free claudin-1 in these subjects.One-way analysis of variance andttest were carried out to compare these parameters in different groups,and Pearson's correlation analysis to estimate the relationship between different parameters.ResultsThe TEWL value was significantly higher in lesional skin than in nonlesional skin of patients with AD and normal skin of the healthy controls((36.9±34.2)vs.(9.1 ± 6.0)and(4.4 ± 3.1)g·m-2·h-1,bothP＜ 0.05).The epidermal thickness in AD lesions was(0.23 ±0.04)mm,significantly higher than that in nonlesional skin((0.18±0.03)mm,P＜0.01)and normal control skin((0.18±0.02)mm,P＜0.01).Ultrasound images revealed a characteristic subepidermal low echo-genic band in the AD lesions.The patients with AD showed a significantly lower serum level of claudin-1 compared with the healthy controls((0.80±0.88)vs.(1.73±1.85)μg/L,P＜0.05).Moreover,the serum level of claudin-1 was negatively correlated with epidermal thickness(r=-0.61,P＜0.01),but positively correlated with the inverse of TEWL(1/TEWL,r=0.44,P＜0.05).ConclusionsThe impaired skin barrier function,which may be evaluated by TEWL,1/TEWL and epidermal thickness,is associated with the expression of claudin-1 in patients with AD.

Dermatitis,atopic;Skin barrier;Claudin-1;Tight junction proteins

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.013

2011年中国医师协会皮肤屏障修复基金

王学民,Email:dermxmwang@126.com