结直肠癌患者外周血Tc17细胞在肿瘤进展中的变化

王建升 帖彦清 张立志 吕元鹏 宋津晓(河北省人民医院检验科，石家庄050051)

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤的第二位，超过50%的结直肠癌患者最终死于肿瘤远处转移相关的并发症［1］。近年来，我国结直肠癌的发病率在逐年上升，在大城市尤为显著［2］。因此，结直肠癌已成为我国城乡居民生命安全的主要威胁。

Tc17细胞是一类由初始CD8+T细胞分化而来的效应T细胞，能特异性的产生IL-17，具有不同于Tc1 型和 Tc2 型细胞的分化、发育调节机制［3，4］。Tc17细胞介导炎性反应，并参与肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等的发生和发展，是近年来免疫学研究中的一个热点［5］。但目前对于Tc17细胞及其相关的细胞因子在结直肠癌进展中究竟是如何变化的，国内外还没有相关的报道。

在本研究中，我们用流式细胞仪检测结直肠癌患者外周血中Tc17细胞比例的变化;用ELISA法检测结直肠癌患者外周血中IL-1β、IL-17A、IL-6和IL-23水平的变化;为确定这些细胞因子水平的变化是造成Tc17细胞数量变化的主因，我们用淋巴细胞体外培养试验观察不同浓度的 IL-1β、IL-6和 TGF-β对外周血单个核细胞(PBMCs)中Tc17细胞分化诱导的影响，以阐明结直肠癌患者外周血中影响Tc17细胞扩增的可能机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 标本来源于河北省人民医院2010年6月至2012年12月结直肠腺癌患者(结肠腺癌26例，直肠腺癌28例)，男27例、女27例，年龄43～86岁，平均65岁。所有患者的血标本收集前均未行放射治疗、化学治疗、生物治疗及中西医结合治疗。所有病例均经病理诊断证实且确定其病理分型、临床分期。根据AJCC颁布的结、直肠癌TNM分期标准将54例结直肠腺癌患者按临床病理分期分为两组:早期结直肠腺癌组(Ⅰ、Ⅱ)25例;晚期结直肠腺癌组(Ⅲ、Ⅳ)29例。健康志愿者17例，男9例、女8例，年龄44～83岁，平均65岁。所有受试者均签署知情同意书，并报伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 Ficoll-Hypaque分离液购自Sigma公司;重组IL-1β、IL-6和TGF-β购自PeproTech公司;佛波酯、离子霉素、布雷菲得菌素A、FIX＆PERM Kit Reagent、抗人 CD3、CD28、CD8、IL-17A 及其相应的同型对照、IL-1β、IL-6、IL-17A 和 IL-23 ELISA 试剂盒均购自eBioscience公司。

1.3 标本收集 所有受试对象于清晨抽取空腹外周血，其中4 ml置入肝素钠抗凝管内，淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque液)分离外周血PBMCs用于流式细胞学检测;5 ml外周血离心后取血清储存于－80℃以备分析细胞因子用。

1.4 Tc17细胞流式检测 分离的PBMCs以1×106ml/孔铺于48孔培养板中，每孔加入1 μg/ml离子霉素和 25 ng/ml佛波酯各 20 μl，然后加入 10 μg/ml布雷菲得菌素 A 20 μl，于5%CO2孵箱37℃孵育5 h。用FITC标记的抗人CD8单抗和PE-Cy5标记的抗人CD3单抗进行细胞表面分子的染色，通过Reagent A固定、Reagent B破膜后再用PE标记的抗人IL-17A单抗标记胞内抗体，0.5 ml 1%多聚甲醛PBS重悬细胞上流式细胞仪进行检测，采用CellQuest分析软件对结果进行分析。Tc17细胞以CD3+CD8+IL-17+T细胞在CD3+T细胞中的百分比表示。

1.5 PBMCs体外培养 96孔细胞培养板的每孔各加50 μl含4 μg/ml抗CD3单克隆抗体的PBS液，置于4℃冰箱16 h后弃液备用。取7例健康志愿者的外周血，用Ficoll-Hypaque分离PBMCs后重悬于RPMI1640完全培养液中，按1×106细胞/孔加入96孔板中，每孔 100 μl;每孔加入 2 μg/ml可溶性抗CD28单克隆抗体，再向各孔中加入以下细胞因子:第一孔为0.5 ng/ml TGF-β;第二孔为5 ng/ml TGF-β;第三孔为50 ng/ml IL-6;第四孔为25 ng/ml IL-6;第五孔为50 ng/ml IL-6和5 ng/ml TGF-β;第六孔为10 ng/ml IL-1β;第七孔为25 ng/ml IL-1β。其中不加任何细胞因子仅含培养液的孔作为对照。置于37℃、CO2孵箱中培养84 h。收集细胞进行Tc17细胞流式检测。

1.6 ELISA检测 收集所有受试对象的血清，用双抗体夹心法进行人 IL-1β、IL-17A、IL-6和 IL-23的ELISA检测。操作过程均按ELISA试剂盒说明书进行。细胞因子的浓度以pg/ml表示。

1.7 统计学分析 所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，结果用x－±s表示。数据符合正态分布，采用两独立样本t检验;数据不符合正态分布(呈偏态分布)，采用两独立样本秩和检验。相关分析采用Spearman相关分析法。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌患者外周血Tc17细胞及其相关细胞因子的变化 晚期结直肠癌患者外周血中Tc17细胞比例(P＜0.001)及 IL-17A(P=0.026)、IL-23(P＜0.001)、IL-1β(P=0.001)和 IL-6(P＜0.001)水平都高于健康对照。早期结直肠癌患者外周血中的Tc17细胞的比例明显高于晚期患者(P＜0.001)。与早期结直肠癌患者相比，晚期患者外周血中IL-1β(P=0.013)、IL-17A(P=0.001)和 IL-23(P=0.305)水平降低，但 IL-6 水平升高(P=0.009)。见图1和表1。

2.2 结直肠癌患者外周血Tc17细胞与IL-1β、IL-23、IL-6相关性分析 结直肠癌患者外周血中的Tc17细胞与IL-1β、IL-23呈正相关，但与IL-6无相关性。见图2。

表1 早、晚期结直肠腺癌患者和健康对照外周血中Tc17细胞比例及其相关细胞因子水平的比较Tab.1 Proportions of circulating Tc17 cells and serum levels of their related cytokines in patients with early and advanced CRC and healthy controls

图2 结直肠癌患者外周血Tc17细胞与IL-1β、IL-23、IL-6相关性分析Fig.2 Correlation between Tc17 cells and IL-1β，IL-23 or IL-6 in CRC patients

图3 不同浓度的 IL-1β、IL-6和 TGF-β对 PBMCs中Tc17细胞分化诱导的影响Fig.3 Effect of different concentration of IL-1β，IL-6 and TGF-β on proportion of Tc17 cells in PBMCs

2.3 IL-1β、IL-6 和 TGF-β 对 PBMCs中 Tc17 细胞分化诱导的影响 与对照相比，低浓度的IL-1β(IL-1βlo，10 ng/ml)能增加了 PBMCs中 Tc17 细胞的比例(P=0.029);与 IL-1βlo相比，高浓度的 IL-1β(IL-1βhi，25 ng/ml)使 PBMCs中 Tc17 细胞的比例明显增多(P=0.009)。尽管高浓度的TGF-β(TGF-βhi，5 ng/ml) 或低浓度的 TGF-β(TGF-βlo，0.5 ng/ml)都能促进PBMCs中Tc17细胞的比例增多，但与对照相比，并无统计学差异(TGF-βhi，P=0.277;TGF-βlo，P=0.064)。高浓度的 IL-6(IL-6hi，50 ng/ml)和低浓度的IL-6(IL-6lo，25 ng/ml)虽不能增加PBMCs中 Tc17 细胞的比例(P＞0.05)，但 IL-6hi和TGF-βhi共同作用反而大大增加了 PBMCs中 Tc17细胞的比例(IL-6hi，P=0.002;TGF-βhi，P=0.002)。见图3。

3 讨论

Tc17细胞是一类促炎性细胞，其在感染性疾病和自身免疫性疾病中的研究颇多，但在肿瘤中的报道较少。胃癌患者外周血和肿瘤组织中的Tc17细胞随着疾病的进展而增加，且肿瘤组织中的Tc17细胞比例明显高于外周血，高比例的Tc17细胞与胃癌患者的总生存期和无病生存期呈负相关，并可作为一个独立的预后指标［6］。与健康人外周血相比，鼻咽癌患者外周血中有低比例Tc17细胞，而瘤组织则存在高比例Tc17细胞，这是因为Tc17细胞能高表达CCR6，而肿瘤组织高表达 CCL20，后者能募集Tc17细胞到肿瘤微环境中，致使患者外周血中的Tc17细胞数量减少［7］。我们的结果表明，结直肠癌患者外周血中Tc17细胞的比例高于健康对照，但随着疾病的进展，其在结直肠癌患者外周血中的比例反而减少，其特征是细胞因子IL-17A也呈现类似的变化趋势，我们推测结直肠癌患者外周血中的Tc17细胞随着肿瘤的发展也可能被募集到肿瘤组织中，不过，这一推测尚待进一步证实。

尽管我们对Th17细胞的分化发育过程有了更深入的了解，但对Tc17细胞的分化发育目前有所争议。IL-6和TGF-β能诱导鼠初始CD8+T细胞分化为Tc17细胞［8］，IL-23是一种更有效地促进Tc17细胞发育的关键细胞因子［9］。然而，Dwivedi等［10］报道，TGF-β对鼠体内的Tc17细胞分化是不需要的，它的存在反而抑制Tc17细胞的分化。在胃癌和肝癌患者的肿瘤组织中，肿瘤活化的单核细胞(Tumoractivated monocytes)分泌 IL-1β、IL-6 和 IL-23，这些细胞因子促进了 Tc17细胞的分化［6，11］。我们的结果表明，Tc17细胞的比例和IL-1β、IL-23的水平有一致的变化趋势，而与IL-6水平的变化恰好相反。相关性分析表明，结直肠癌患者外周血中的Tc17细胞与IL-1β、IL-23呈正相关，但与 IL-6无相关性。另有研究表明，结直肠癌患者血清中TGF-β水平随着疾病的进展呈明显增高［12，13］。由此我们推测不同浓度的IL-1β、IL-6和TGF-β在诱导Tc17细胞的分化中可能起着一定的作用。体外试验证实，IL-1β能诱导PBMCs中Tc17细胞的分化;虽然TGF-β也能诱导PBMCs中Tc17细胞的分化，但与对照相比并无统计学差异;尽管IL-6不影响PBMCs中Tc17细胞的分化，但高浓度的IL-6和高浓度的TGF-β共同作用于PBMCs反而促进Tc17细胞的分化，说明TGF-β和IL-6在调节Tc17细胞的分化发育中确实起一定的作用。另外，我们的体外试验没有选择IL-23，是因为IL-23是一种公认的使Tc17细胞扩增和功能维持的重要细胞因子［5］。

总之，通过分析Tc17细胞在结直肠癌早、晚期的差异，我们发现Tc17细胞在疾病早期阶段高表达，而在晚期阶段低表达。通过对外周血中与其分化相关的细胞因子检测，发现Tc17细胞的变化总是伴随着 IL-1β、IL-6和 IL-23的变化。体外试验证实，IL-1β、高浓度的IL-6和高浓度的TGF-β在调节Tc17细胞的分化发育中起着决定性作用，进一步支持了其分化所需要的微环境。可见，更好地了解结直肠癌进展中Tc17细胞及其相关细胞因子的变化将能大大激励更深入对结直肠癌发展中免疫机理的研究和探索。

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