Smoothened、STAT3和MMP-9在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义

方 明 康 乐 陈英杰 刘 健 马君燕 陶雅军

(大连医科大学附属第一医院，大连 116001)

乳腺癌是一种异质性疾病，临床病理分型较为复杂，因此根据乳腺癌基因表达谱对每一型乳腺癌患者进行个体化治疗非常重要。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的一种亚型，指雌激素受体(Estrogen receptor，ER)、孕激素受体(Progesterone receptor，PR)均阴性且人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)无过表达的乳腺癌。TNBC约占全部乳腺癌的10%～17%，和其他类型乳腺癌相比，其更富有侵袭性，转移早、复发率高，患者生存时间明显缩短［1-3］。

尽管还没有明确的鉴定标志，但电镜研究已揭示位于乳腺导管基底及其上部、数量极少、未分化呈电子半透明状的细胞即为乳腺干细胞［4］。成体干细胞因其寿命长且相对未分化，能够累积各种突变，因此成为癌症发生的可能靶标。在三阴性乳腺癌组织中含有较多的基底样型癌细胞，乳腺癌干细胞可能位于其中，故推测三阴性乳腺癌患者的预后较其他类型乳腺癌差的重要原因是其肿瘤组织中乳腺癌干细胞的数量更多或活化程度更高。Smoothened(SMO)基因是参与调控肿瘤干细胞活化的重要基因，信号转导子及转录活化子3(Signal transducers and activators of transcription，STAT3)在肿瘤干细胞自我维持与更新中具有重要作用，因此亦被看做是参与调控肿瘤干细胞的重要基因。MMP-9在肿瘤的侵袭、浸润等方面具有重要作用。本研究旨在通过研究SMO、STAT3和MMP-9在三阴性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中的表达差异及与三阴性乳腺癌临床病理因素的关系，探讨它们在乳腺癌干细胞激活及在三阴性乳腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 33例三阴性乳腺癌、30例乳腺增生及18例癌旁正常乳腺组织石蜡标本均采集自2008年5月～2012年11月大连市中心医院病理科存档标本。33例乳腺癌患者术前均未接受放疗、化疗、激素或免疫治疗，患者平均年龄52.3岁，病理类型均为浸润性导管癌，病理分期依据AJCC标准［5］，其中Ⅰ期8例、Ⅱa期11例、Ⅱb期6例、Ⅲa期4例和Ⅳ期4例。

1.2 试剂与方法 SMO兔抗人单克隆抗体(ab72130)、STAT3兔抗人单克隆抗体(ab15523)均购自英国Abcam公司。鼠抗人MMP-9单克隆抗体、SP广谱超敏试剂盒、DAB酶底物显色剂等均购于福建迈新生物技术开发公司。实验分为三阴性乳腺癌组、乳腺增生组及正常乳腺组，免疫组化SP法及DAB显色操作步骤均按照说明书进行。按照抗体说明用已知卵巢癌阳性切片作为SMO阳性对照，子宫内膜腺癌阳性切片作为STAT3阳性对照，基底细胞癌阳性切片作为MMP-9阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 SMO和MMP-9蛋白阳性表达均为胞浆内出现棕黄色颗粒，STAT3蛋白阳性表达为胞核内出现棕黄色颗粒。免疫组化结果采用半定量法进行判定，根据染色密度(阴性=0、弱阳性=1、中度阳性=2、强阳性=3)和阳性细胞百分比(0=阴性、1=＜25%、2=25%～50%、3=51%～75%、4=＞75%)的乘积计算5个高倍视野的免疫反应评分(Immuno-Reactive-Score，IRS)。最后结果:阴性(IRS:0):－，弱阳性(IRS:1-4):+，中度阳性(IRS:5-8):++，强阳性(IRS:9-12):+++。

1.4 统计学分析 数据处理应用SPSS 14.0统计学软件，采用 χ2检验对 SMO、STAT3、MMP-9蛋白在三阴性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中的表达进行分析，用Spearman等级相关分析SMO、STAT3、MMP-9在乳腺癌组织中表达的相关性，生存分析采用Cox回归的多因素分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 SMO、STAT3、MMP-9 蛋白在三阴性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中的表达 SMO蛋白在三阴性乳腺癌和乳腺增生组织中的阳性表达率分别为90.9%和60.0%，在正常乳腺组织中无表达;STAT3蛋白在三阴性乳腺癌和乳腺增生组织中的阳性表达率分别为96.9%和73.3%，在正常乳腺组织中无表达;MMP-9蛋白在三阴性乳腺癌和乳腺增生组织中的阳性表达率分别为90.9%和36.7%，在正常乳腺组织中无表达;SMO、STAT3和MMP-9蛋白表达在三阴性乳腺癌、乳腺增生及正常乳腺组织中均有显著差异(均 P＜0.05)，见表1、图1。

表1 SMO、STAT3、MMP-9蛋白在三阴性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中的表达Tab.1 Expression of SMO，STAT3 and MMP-9 in TNBC，mammary hyperplasia and normal breast tissue

表2 SMO、STAT3、MMP-9蛋白表达与三阴性乳腺癌临床病理因素的关系Tab.2 Relationships between expression of SMO，STAT3，MMP-9 and clinicopathological parameters in TNBC

图2 三阴性乳腺癌患者生存情况Fig.2 Survival data of TNBC

2.2 SMO、STAT3、MMP-9 蛋白表达与乳腺癌临床病理因素的关系 由表2可知，SMO的表达与乳腺癌组织学分级、pTNM 分期有关(P=0.036，P=0.002)，其表达随着组织学分级和临床分期的增高而增高;STAT3的表达亦与乳腺癌组织学分级、pTNM 分期有关(P=0.004，P=0.038)，其表达随着组织学分级和临床分期的增高而增高;SMO和STAT3的表达均与患者年龄、淋巴结转移无关(均P＞0.05);MMP-9的表达与淋巴结转移有关(P=0.009)，与患者年龄、组织学分级以及临床分期均无关(均P＞0.05)。Spearman相关检验显示SMO和STAT3(r=0.361，P=0.039)、SMO 和 MMP-9(r=0.633，P=0.000)、MMP-9 和 STAT3(r=0.803，P=0.000)在三阴性乳腺癌中的表达均相关。

2.3 三阴性乳腺癌患者预后相关因素 三阴性乳腺癌患者生存情况见图2，Cox回归分析显示，最终进入回归方程的是 SMO［Exp(B)=10.677，P=0.022］和pTNM 分期［Exp(B)=1.889，P=0.002。］

3 讨论

目前关于三阴性乳腺癌发生发展的确切机制尚不清楚，但有研究认为癌症干细胞愈丰富的肿瘤患者其预后愈差。由于三阴性乳腺癌具有复发率高、易转移、耐药及生存期短等特点，因此推测在三阴性乳腺癌组织中可能具有较多的处于活化状态的癌症干细胞，并且相关调控基因的表达异常在癌症干细胞的活化过程中起了非常重要的作用。SMO基因属于原癌基因，编码SMO蛋白负责Hedgehog信号通路的传导，对于癌症干细胞自我更新及分化潜能的维持至关重要，其突变与皮肤、脑、肝、肺、前列腺、胰腺、卵巢等器官的恶性肿瘤发生均有关［6-8］。本研究发现在乳腺增生组织中SMO的表达增加，且与正常乳腺组织相比具有显著性差异，提示在乳腺组织中细胞的增殖与SMO的激活有关，推测SMO可能参与诱导乳腺干细胞进入细胞周期以扩大乳腺干细胞池进而促进乳腺增生的形成。而与乳腺增生相比，在三阴性乳腺癌组织中SMO的表达亦明显增加，提示在正常乳腺-乳腺增生-三阴性乳腺癌这一连续发展的过程中SMO的激活可能参与乳腺干细胞向乳腺癌干细胞的转化从而促进乳腺癌的发生。Moraes等［9］报道在MMTV启动子控制下的人SMO(SmoM2)激活可导致转基因鼠乳腺导管增生、增强原始乳腺球的形成能力、促进早期乳腺癌的发展，这与本研究结果一致。STAT3基因是人类胚胎期干细胞自我更新的重要基因，在很多上皮组织恶性肿瘤中均有激活。活化的STAT3介导多种基因的表达，如twist、snail、IL-8以及干细胞标志Oct-4等，可抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖与转移、抑制抗肿瘤免疫应答等，与肿瘤患者的预后密切相关［10，11］。此外，有研究表明STAT3的激活能促进癌症干细胞的增殖并抑制其分化，而抑制STAT3的表达则可阻止癌症干细胞的生长［12］。本研究发现在乳腺增生和三阴性乳腺癌组织中STAT3的表达均增加，且STAT3的表达在三阴性乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中均具有显著性差异，提示STAT3的激活可能参与乳腺干细胞向乳腺癌干细胞的转化进而促进乳腺癌的发生。在本研究中SMO和STAT3蛋白的表达均随着组织学分级和临床分期的增高而增高，且SMO的表达与STAT3具有相关性，提示SMO和STAT3可能协同调控乳腺癌干细胞的激活进而参与到乳腺癌的进一步发展过程中。MMP-9是降解细胞外基质的主要酶类，可分解基底膜中的纤维连接蛋白和层粘连蛋白促进肿瘤细胞的迁移，MMP-9亦是STAT3的下游作用因子［13］，而MMP-9的活化又可进一步激活STAT3［14］。本研究显示MMP-9的表达与乳腺癌的淋巴结转移有关，且MMP-9的表达与SMO和STAT3的表达均明显相关，提示活化的SMO和STAT3可能通过与MMP-9的相互作用进而促进乳腺癌的浸润和转移。本研究还发现SMO的高表达与三阴性乳腺癌患者的生存期短明显相关，进一步说明SMO的靶标可能就是干细胞。这些研究结果提示SMO和STAT3在三阴性乳腺癌的发生发展中具有重要作用，其可作为三阴性乳腺癌患者治疗的重要靶标，但SMO和STAT3如何促进乳腺干细胞的恶性转化，SMO和STAT3之间的相互关系等问题还需深入研究。

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