食蟹猴实验感染HBV的血清学反应①

王振常 梁增文 冷 静 韦 毅 黄晶晶 陈松林(广西中医药大学第一附属医院，南宁530023)

HBV感染呈世界性流行，据统计我国人群中HBsAg阳性率平均为7.18%(中国广西地区属高流行区:HBsAg阳性率高达10%，10年来乙肝报告发病率呈显著的逐年增高趋势)［1，2］，每年全世界约有100万人、我国约有30万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等相关性肝病。HBV感染已成为全球面临的严重公共健康问题之一，面临的防治形势十分严峻。

乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗接种对HBV感染有很好的预防作用，但有部分接种者无应答;临床上抗病毒药物能有效控制病毒复制，但需要长期服药，面临着患者产生耐药性、治疗无应答、不良反应严重等问题［3］，此外，对肝脏病变本身还没有有效的治疗方法。造成这一局面的主要原因是由于没有能进行HBV自然感染且能反映临床乙肝发生、发展过程的理想动物模型，导致目前对HBV感染的致病机制和肝脏病变的发展及转归认识还很不全面和深入。本实验旨在报道食蟹猴对HBV攻毒后的血清学反应，为该动物模型的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 实验室内人工繁育的1～3日龄或成年食蟹猴各12只(防城港常春生物技术开发有限公司提供)观察1个月经病毒学筛选证实为健康动物后，各随机分为对照组(6只)、感染组(6只)，感染组食蟹猴接种HBV携带者血清0.5 ml(HBV-DNA≥108拷贝)单只笼养。对照组注射HBsAg阴性正常血清 0.5 ml。

1.2 方法 各组从接种后1～12周每日观察行为变化，每1周取血样检测HBV-M、HBV-DNA、肝功能及于对于HBsAg阳性食蟹猴在B超引导下取肝组织常规HE染色检测肝组织炎症程度。

检测方法:(1)HBV-M用化学发光法检测，试剂购自安图;(2)采用实时荧光定量PCR检测HBV-DNA的浓度，试剂购自上海浩源生物工程公司;(3)ALT、AST的检测采用日立7600全自动分析仪及其配套试剂检测。

2 结果

2.1 一般状态 攻毒后至ALT、AST出现应答的食蟹猴出现轻度倦卧，大便溏烂，小便黄，全部实验持续进行3个月，未见死亡动物。

2.2 血清学检查

2.2.1 HBV-M的应答及HBV-DNA结果 见表1。如表所示成年猴接种后未引发HBsAg阳性反应，有3只幼年猴出现HBsAg、HBcAb(按检测例次统计阳性率为50%)及2只出现HBV-DNA反应(按检测例次统计阳性率为33.33%)。

2.2.2 ALT、AST反应 ALT在攻毒出现HBsAg阳性后1周开始升高，1个月后达到高峰，其值为180 U/L，以后渐降，持续1个月后接近正常。AST 1周后高于正常参考值(60 U/L)呈低平曲线，高峰较ALT迟1个月。两者升高值约为正常参考值的2～6倍。

2.3 肝组织病理学结果 见图1。图2为正常肝组织的HE染色结果。HE染色可见部分肝组织呈轻微肝炎病变，肝细胞呈气球样变，部分区域有点状坏死，小叶界板尚完整，基本与人类乙型肝炎病理改变相似。

表1 食蟹猴HBV-M、HBV-DNA的检测结果(时间:周)Tab.1 Detection result of HBV-M and HBV-DNA to cynomolgus monkeys(time:week)

图1 病变肝组织Fig.1 Tissue of resions

图2 正常肝组织Fig.2 Tissue of normal liver

3 讨论

目前已知的5种病毒性肝炎动物模型均已建立。非人类的灵长类动物(黑猩猩、长臂猿等)可以感染HBV，且感染的HBV基因型与感染人类的基本一样［4］，其感染HBV后的血清学和肝脏病理组织学改变与人较接近。因其来源受限，其疾病程度比人要轻得多，无法作为肝硬化及肝癌的研究模型;进一步又寻求长臂猿、食蟹猴、熊猴、红面猴等动物进行实验感染HBV，将为乙肝动物模型的研究带来新的希望［5］。国内学者用树鼩和板鸭作为乙肝的动物模型取得较大进展，但也有不足之处［5］。

曾经认为除黑猩猩之外，尚无其他非人灵长类动物可作为理想的乙肝动物模型，但关于猴乙肝病毒感染动物模型国内外却有少数成功建模的报道。

食蟹猴(Macaca fascicularis)又称长尾猕猴，属于哺乳纲灵长目猕猴属，是目前国内外使用量最大的非人灵长类实验动物。其生物进化程度高，无论是在生理学、遗传学还是生物学特性上与人类都极相似，与人类的遗传物质有75.0%～98.5%的同源性。根据调查，中国是世界上少数几个非人灵长类动物资源丰富的国家之一，是目前世界上最大的实验猴出口国，国内外医学实验中常用的猴子有恒河猴和食蟹猴，这两种猴子也是中国目前人工驯养繁育灵长类动物的主要品种。广西实验食蟹猴的存栏量和生产量均居全国首位，成功建立全国最大的食蟹猴饲养繁育基地，并开始投入人力、物力建立食蟹猴重大疾病模型的研究。由于实验动物资源和其他原因的限制，国内外关于食蟹猴乙型肝炎动物模型的研究目前仍属空白。

国内学者葛宪民等［6］于1987～1990年进行了3种猴(熊猴、红面猴、獭猴)实验感染HBV后的历时12周动态肝活检组织观察，证实了猴乙型肝炎动物模型的成功建立。张涛等通过60Co全身照射处理大量杀伤机体的造血细胞和免疫细胞后(历时12周)，可以明显地提高恒河猴对HBV的敏感性，有异于以往学者认为HBV感染恒河猴后无生化及肝组织学改变的观点［7］。研究认为恒河猴可以作为一种研究HBV感染的动物模型，感染后可在血清中检测到HBsAg，但浓度较低，其敏感性低于黑猩猩。如前研究已证实了类人猿、黑猩猩、猴等高等非人灵长类动物建立乙型肝炎动物实验模型的可行性。

我们研究食蟹猴感染HBV后的血清学反应，旨在探索动物模型的建立。虽至今无成熟的报道，但从本文近来的血清反应结果显示出新的苗头。首先，用含HBV-DNA的人血清攻毒后幼年食蟹猴陆续出现HBsAg阳性率为 50.0%(3/6)，HBcAb阳性率为50.0%(3/6)，同时检出 HBV-DNA 为16.67%(2/6)，ALT 1周后反应性升高，1个月后达高峰，持续近1个月渐复常，AST较ALT高峰晚1个月，其峰值达正常参考值的2～6倍。肝组织HE染色可见部分肝组织呈轻微肝炎病变，肝细胞呈气球样变，部分区域有点状坏死，小叶界板尚完整，基本与人类乙型肝炎病理改变相似(见图2)。幼年食蟹猴感染HBV后，血清中很快出现抗HBe抗体及HBs抗体，HBsAg快速消失，肝组织学反应与人急性肝炎过程相仿，这一点和人的急性自限性肝炎很相似，有可能用来研究HBV感染、HBV感染过程中宿主的免疫反应。

但从实验猴的一般情况来分析攻毒后仅个别实验猴出现稍微疲倦、大便溏烂等不适症状，但未见实验动物死亡，与其他动物实验研究文献报道的多点、大量攻毒后出现如食欲下降、竖毛、精神萎靡、易激惹、甚至部分实验动物出现死亡等严重反应明显偏轻［8］，这说明我们可在加大攻毒量、多点注射部位及攻毒后免疫调节等方面优化实验方法，并利用更理想、专门的检测试剂，可能会提高实验成功率及结果的敏感性，本文研究为初步结果，实验尚在继续完善中。

［1］梁晓峰，陈园生，王晓军，等.中国3岁以上人群乙型肝炎血清学流行病学研究［J］.中华流行病学杂志，2005，26(9):347-351.

［2］沈立萍，杨进业，莫兆军，等.广西壮族自治区1996-2005年乙型肝炎发病状况监测分析［J］.疾病控制杂志，2007，11(2):210-211.

［3］Mailliard ME，Gollan JL.Emerging therapeutics for chronic hepatitis B［J］.Annu Rev Med，2006，57:155-166.

［4］Kamili S，Sozzi V，Thompson G，et al.Efficacy of hepatitis B vaccine against antivirial dru-resistant hepatitis B virus mutants in the chimpanzee model［J］.Hepatology，2009，49(5):1483-1491.

［5］魏泓主编.医学实验动物学［M］.成都:四川科技出版社，1998:347-346.

［6］葛宪民，黄果勇，王树声.猴的人HBV实验感染的现代病理学研究［J］.广西预防医学，1996，2(4):226-228.

［7］张 涛，王树声，黄果勇，等.猕猴感染人乙肝病毒动物模型病理学研究［J］.广西预防医学，2001，7(1):12-15.

［8］赵素元，黄 星，邹 林，等.灰旱獭实验感染HBV的血清学反应［J］.中国实验动物学杂志，2002，12(2):80-81.