探讨维族食管鳞癌病人Hp感染与癌细胞增殖及侵袭的关联研究

金澄宇 郭 睿 马金山 努尔兰 李先锋(新疆维吾尔自治区人民医院胸外科，乌鲁木齐 830001)

食管癌是原发于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，尤其是食管鳞状细胞癌，发病率在全世界存在着较大的区域性、种族性和民族差异性［1］。在我国的新疆地区，哈萨克族和维吾尔族的发病率高居不下，分别名列第一、二位。近来研究发现，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染与食管癌的关系十分密切［2］。Ki67是增殖细胞核抗原，表达于除G0、G1早期以外的细胞周期中，是可靠而全面地反映细胞群体增殖活性的客观指标［3］。基质金属蛋白酶2(Maixmetalloproteinases2，MMP2)是 MMPs家族的一员，可以降解细胞外基质，促进新生血管的形成，促进肿瘤的侵袭和转移［4］。为探讨Hp感染与肿瘤增殖和侵袭恶性程度的关联，本文采用免疫组织化学技术检测新疆维族食管鳞癌组织中Hp感染与Ki67和MMP2的表达情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院2010年1月至2013年6月原发性食管鳞癌手术切除病理组织石蜡标本164例，所有患者术前未经放化疗治疗。男性118例，女性46例，年龄20～80岁，平均年龄56.6岁，皆为维吾尔族。另选择我院30例创伤死亡尸检标本的食管组织作为对照组，该组标本均经组织学确认为正常组织。其中男性17例，女性13例，年龄 32～78岁，平均年龄54.1岁，皆为维吾尔族。两组在年龄、性别方面无显著性差异(P＞0.05)。所有标本均经10%中性福尔马林液固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，并均经HE染色后确认病理诊断，临床资料完整。

1.2 试剂和方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人 Hp抗体(Abcam，1∶1 000)、兔抗人 Ki67抗体(Abcam，1∶100)均购自武汉博士德生物工程有限公司;鼠抗人MMP-2抗体(Abcam，1∶1 000)购自上海太阳生物技术有限公司;免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色 采用SP法二步，Hp阳性对照组织为正常胃组织;Ki67阳性对照组织为正常扁桃体组织，MMP2阳性对照组织为乳腺癌组织。PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判定 采用双盲法观察阳性反应。Hp阳性表达定位于细胞质，阳性部位呈棕黄色;而Ki67阳性表达定位于细胞核，阳性部位呈棕黄色。无棕黄色表达者为阴性。MMP2阳性表达定位于细胞质。随机选择10个高倍视野(放大倍数400倍)，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞数所占的百分数均值，当此均值 ＞10%即为阳性表达。

1.3 统计学方法 本实验研究数据用率或者百分数表示，使用SPSS17.0统计软件进行相关统计学处理，组间比较采用卡方检验，两变量关联性分析采用卡方检验及Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌及对照组中Hp、Ki67和MMP2抗原检测结果 Hp、Ki67和MMP2在食管癌及对照组中的表达情况依次如图1所示，食管癌中Hp阳性率81.7%，对照组Hp阳性率26.7%。食管癌组与对照组比较有显著统计学差异(χ2=39.16，P＜0.01)，见表1。食管癌中Ki67阳性率67.1%，对照组Ki67阳性率6.67%，食管癌组与对照组比较有显著统计学差异(χ2=37.92，P＜0.01)，见表1。食管癌中MMP2阳性率86.6%，对照组MMP2阳性率13.4%，食管癌组与对照组比较有显著统计学差异(χ2=47.07，P＜0.01)，见表1。

2.2 食管癌及对照组中Hp感染与Ki67抗原表达的相关性 表2示，食管鳞癌患者中Hp阳性表达组的Ki67抗原的阳性表达率明显高于Hp阴性组。分析表明，食管癌中Hp的检出率与Ki67抗原阳性表达密切相关(rs=0.340，P＜0.01)，见表2。

2.3 食管癌及对照组中Hp感染与MMP2抗原表达的相关性 表3示，食管鳞癌患者中Hp阳性表达组的MMP2抗原的阳性表达率高于Hp阴性组。分析表明，食管癌中Hp的检出率与MMP2抗原阳性表达密切相关(rs=0.739，P＜0.01)，见表3。

图1 食管癌组织与对照组中Hp、Ki67和MMP2的表达情况Fig.1 Expression of Hp(A，D)，Ki67(B，E)and MMP2(C，F)in tissues of esophageal carcinoma and control group

表1 食管癌及对照组中Hp、Ki67和MMP2抗原检测结果Tab.1 Results of antigen(Hp，Ki67，MMP2)detection for esophageal carcinoma and control group

表2 食管癌Hp表达与Ki67表达的关系Tab.2 Relationship between Hp expression and Ki67 expression in esophageal carcinoma cells

表3 食管癌Hp表达与MMP2表达的关系Tab.3 Relationship between Hp expression and MMP2 expression in esophageal carcinoma cells

3 讨论

世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将Hp纳入第一类致癌原，随着对Hp致病性的深入研究，Hp感染在食管癌发生、发展中的作用已引起人们注意，有关Hp与食管癌研究的报道也随之增加。有研究指出，人群中食管的Hp感染率约为胃的Hp感染率的1/3，而在食管鳞癌中，Hp检出率很高，且与食管鳞癌癌变的好发部位是一致的［5］。我国Hp感染率为40%～60%，但存在很大的地区差异。本实验表明，Hp在维族中感染率很高，且与食管癌的发生有重要的关系。本结果与其他认为新疆维族Hp感染率明显低于国内平均水平的研究相反［6］。

Ki67是由分子量为345 kD和395 kD的两条多肽链组成的核蛋白。Ki67在有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，优于目前常用的增殖细胞核抗原(PCNA)，被认为是可靠而全面地反映细胞群体增殖活性的客观指标［7］。在癌前病变阶段，长期持续的Hp感染可促进Ki67的过度表达，其中的推测理由是幽门螺杆菌释放的脂多糖、尿素酶、空泡毒素与黏附素等重要的毒性致病因子刺激上皮细胞受体，宿主会出现生长抑素分泌紊乱、炎性介质释放、氧自由基形成、上皮细胞增殖与凋亡失衡、癌基因与抑癌基因突变等改变。在本研究中，Ki67在食管癌中明显表达，且与Hp感染成相关性。Ki67在新疆维族中阳性率较高，表明新疆食管癌增殖能力较强，破坏性较大，危害性更严重。

MMP2是MMPs家族中重要的一员，是降解基底膜成分Ⅳ型胶原纤维的主要酶。在癌细胞的侵袭和转移中起重要作用［8］。在本研究中，MMP2在食管癌中表达明显，且与Hp感染成相关性。MMP2在新疆维族中阳性率极高，表明新疆食管癌具有较强的侵袭和转移能力。

Hp感染不仅能诱导上皮细胞增殖，同时也可诱导其侵袭和转移，导致上皮细胞增殖和凋亡的异常增加，使细胞具备了向恶性方向转化的条件。其机制可能与Hp感染后引起的炎症反应及释放炎症介质有关，这些因素一方面引起细胞损伤致使细胞增殖加快而增生活跃的细胞，其DNA合成旺盛，易受基因毒致癌物质的损伤，因而易发生基因的不稳而癌变，而增殖过度若超过凋亡速度时，使增殖与凋亡之间失衡，导致了食管癌的形成。另一方面炎症时组织内中性粒细胞及单核细胞等炎性细胞大量浸润，这些炎性细胞在炎症刺激下尚可合成具有高度反应活性的氮氧化物，继而再形成N-亚硝基化合物及硝酸盐和亚硝酸盐等致癌物质，进一步导致DNA的损伤和细胞凋亡，而肿瘤细胞本身持续性释放NO也可促进肿瘤细胞的生长［9］。本实验中，食管癌组Hp、Ki67和MMP2表达明显高于正常对照组，与多数研究结果一致［8，10，11］。在食管鳞状细胞癌中，Ki67和MMP2的表达相应增高，提示Hp的感染与肿瘤增殖和侵袭恶性程度相关。

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