miR-338-5p在肾移植患者的表达及其意义

马旭怡 徐海燕 何小舟 董盼盼 薛 冬 张雁云 张学光

(苏州大学附属第三医院泌尿外科实验室，常州 213003)

肾移植是终末期肾病的最佳治疗手段，其短期存活率已经得到显著提高，但是长期存活率仍然不能让人满意。引起移植肾功能逐渐丧失的原因包括非免疫因素和免疫因素两个方面，而免疫介导的移植排斥被认为是影响移植肾长期存活的主要因素。

自Terasaki提出“移植排斥的体液免疫”理论以来，抗体介导的移植排斥对移植肾长期存活的影响得到越来越多的重视［1-3］。B细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)属于肿瘤坏死因子超家族。BAFF信号对B细胞的分化发育、增殖等发挥重要的调节作用。本项目组前期研究发现，BAFF信号参与肾移植术后抗体介导的排斥，与肾移植长期存活密切相关［4，5］。BAFF 是具有生物功能的细胞因子，BAFF信号异常提示患者体内已经存在某种异常的免疫应答，因而监测BAFF信号并不能很好地预警患者的体液免疫状态。研究亦已发现，microRNA是基因表达的重要调控因子［6，7］。理论上可以认为，存在某种或者某几种调控BAFF表达的microRNA。本项目组前期完成了以BAFF、C4d高表达的急性移植肾排斥组织为试验组，和以BAFF、C4d不表达的间质纤维化/肾小管萎缩的移植肾组织为对照组进行的microRNA芯片试验。生物信息学分析显示 miR-338-5p在BAFF、C4d高表达的急性移植肾排斥组织中显著低表达。对miR-338-5p进行深入生物信息学分析，结果提示miR-338-5p可能直接或者间接调控BAFF参与急性肾移植排斥的过程［8］。

为进一步了解miR-338-5p在肾移植患者的表达特点，及其对BAFF信号的调控作用，本项研究检测了肾移植患者血清miR-338-5p的水平，以及与抗体介导排斥密切相关的分子sBAFF、抗HLA抗体、抗MICA抗体等，统计分析miR-338-5p与这些分子的相关性，进而分析miR-338-5p在肾移植术后抗体介导排斥中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象的一般临床资料如表1所示。选择2009年4月到2013年5月在苏州大学附属第三医院进行随访的肾移植患者共49例，其中男38例，女11例。均为首次肾移植。术后常规服用甲基强的松龙(MP)、酶酚酸酯(MMF)和环孢素(CsA)/他克莫司(FK506)三联免疫抑制治疗。有患者曾应用过胸腺球蛋白或抗IL-2抗体(Basiliximab)。但所有患者均没有服用过抗CD20单抗(Rituximab)。同时选取20名健康志愿者作为对照组，志愿者各项检查指标均在正常范围，均无各种急慢性疾病，无自身免疫病。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 采集所有研究对象的外周血2 ml(EDTA抗凝)，于10℃下3 500 r/min离心5 min，收集上清，置－80℃冰箱保存。

1.2.2 从血清中提取RNA 按试剂盒miRNeasy Serum/Plasma Kit(QIAGEN公司)操作说明，提取血清中总RNA;采用分光光度计(BECKMAN COULTER公司，DU 800系列)检测RNA浓度及纯度。

1.2.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR用引物制剂由大连TaKaRa公司设计并合成，miR-338-5p引物序列为:5'-AACAAUAUCCUGGUGCUGAGU-3'。U6b作为实验的内源性参照。采用试剂盒 SYBR®PrimerScriptTMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa公司)进行逆转录、两步法real-time PCR。简述如下:(1)逆转录过程:37℃逆转录60 min，85℃ 5 s灭活逆转录酶;(2)实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司，7500系列)进行 PCR反应:第一阶段 :95℃ 30 s;第二阶段:95℃ 5 s，60℃34 s，40个循环。miR-338-5p的相对表达量采用2－ΔΔCt来表示(ΔCt=CtmiR-338-5p － CtU6b)。每例标本重复两次，取其平均值。

1.2.4 ELISA法检测血清中可溶性BAFF水平采用Human BAFF/BLys/TNFSF13B Immunoassay试剂盒(R＆D systems)，按试剂盒操作说明检测血清中sBAFF的水平。每例标本重复两次，取其平均值。

1.2.5 Luminex检测肾移植患者血清抗HLA-Ⅰ类抗体、抗HLA-Ⅱ类抗体、抗 MICA抗体的表达

采 用 OneLambda公 司 LABScreenMix(LSM12)试剂盒检测血清中抗HLA-Ⅰ抗体、抗HLA-Ⅱ抗体、抗MICA抗体，操作简述如下:(1)将待测样本12 000 r/min离心5 min去除聚合物;(2)加样板每孔中加入2 μl微珠，然后每孔加入14 μl 1 × PBS;(3)样本离心后，加入7 μl血清样本;(4)用封口膜封严，并用混匀器混匀;(5)室温避光孵育30分钟，孵育过程中轻轻混匀几次;(6)清洗:孵育结束后，每孔加入180 μl 1×Labscreen wash buffer，封口膜封严，用混匀器混匀，3 500 r/min离心5 min，快速将洗液甩入废物箱中，重复清洗3次;(7)每孔加入50 μl二抗，用混匀器混匀;(8)室温避光孵育30分钟，孵育过程中轻轻混几次;(9)二次孵育后，3 500 r/min离心5 min，然后将二抗甩到废物箱中;(10)清洗:重复步骤6两次;(11)清洗完成后，每孔加入60 μl 1×PBS，用混匀器混匀样本，将样本转移到读板中，上机读取结果;(12)采用软件Fusion2.0对数据进行统计分析。平均荧光强度(MFI)值≥1 000时，被认为阳性;MFI值＜500时，被认为是阴性;MFI值 ＞500＜1 000时，则被认为可疑阳性。

表1 一般临床资料()Tab.1 General clinical data()

表1 一般临床资料()Tab.1 General clinical data()

Groups(Male/Female)Serum creatinine(μmol/L)Age(year)Transplantation time(month)209±157 40±8.5 3.5±2.8 1－3 years(5/0) 160±82 39±15 25±8 3－5 years(4/2) 130±14 45±8 53±6＞5 years(15/4) 230±99 53±9 119±46 Volunteers(13/7)Recipients ＜1 year(14/5)－ 41±12.5 －

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件包对数据进行分析。所有的数据以表示，采用 t检验进行两个独立样本均数间的比较，P＜0.05被认为具有统计学意义;采用卡方检验检测各组间抗体阳性率的差异;采用Spearman法对miR-338-5p和 sBAFF、miR-338-5p和抗 HLA-Ⅱ抗体进行相关性分析;采用Pearson法对抗体和sBAFF进行相关性分析。

2 结果

2.1 miR-338-5p在肾移植患者血清的表达特点荧光定量PCR结果显示，移植患者血清miR-338-5p水平显著低于健康组(2.79±2.5 vs 0.09±0.12，P＜0.001)(如图1A所示)。肾移植术后1、3年以内者血清miR-338-5p水平分别显著低于移植术后1、3年以上者(0.04±0.04 vs 0.13±0.14、0.05±0.04 vs 0.14±0.14，P ＜0.01)，两组与健康组比较均有统计学意义(P＜0.01)(如图1B、C所示);肾移植术后5年以内者血清中miR-338-5p水平与移植5年以上者差异不显著(0.08±0.1 vs 0.11±0.13，P＞0.05)，但两组与健康对照组比较均有统计学意义(P＜0.05)(如图1D所示)。

2.2 sBAFF在肾移植患者血清的表达特点 对ELISA获得的数据进行统计分析显示，肾移植患者血清中sBAFF水平显著高于健康组［(1 321±950)pg/ml vs(534 ±327)pg/ml，P ＜0.01］(如图 2 所示)。而肾移植术后不同时间各组间血清中sBAFF水平差异均不显著(P＞0.05)。

2.3 肾移植患者血清中抗体阳性率的分布特点肾移植患者血清中各抗体阳性率与健康组的比较显示，健康组各抗体阳性率均小于移植组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。术后1年内患者血清中抗MICA抗体(P＜0.01)和抗HLA＆MICA抗体(P＜0.05)的阳性率小于术后1年以上者，差异具有统计学意义;术后3年内患者血清中抗MICA抗体(P＜0.01)和抗HLA＆MICA抗体(P＜0.01)的阳性率小于术后3年以上者，差异具有统计学意义;术后5年内患者血清中抗HLA＆MICA抗体(P＜0.01)的阳性率小于术后5年以上者，差异具有统计学意义(如图3所示)。

2.4 血清miR-338-5p与sBAFF的相关性分析 采用Spearman法分析所有研究对象血清中miR-338-5p与 sBAFF的相关性，结果显示 miR-338-5p与sBAFF呈负相关，相关系数为 －0.51(P＜0.001)(如图4所示)。

图1 肾移植患者和健康组血清中miR-338-5p表达水平的比较Fig.1 Comparison of serum miR-338-5p levels between renal transplantation recipients and volunteers

图3 肾移植患者和健康组血清中各抗体阳性率的比较Fig.3 Comparison of serum antibody positive rate between renal transplantation recipients and volunteers

图2 肾移植患者与健康组血清sBAFF水平的比较Fig.2 Comparison of serum sBAFF levels between renal transplantation recipients and volunteers

图4 血清中sBAFF与miR-338-5p水平相关性分析Fig.4 Correlation analysis between serum sBAFF and miR-338-5p

2.5 各种抗体与sBAFF的相关性分析 各抗体MFI值小于1000时与sBAFF相关性均不显著(P＞0.05);抗MICA抗体MFI值大于1000时与sBAFF呈显著负相关，相关系数r=－0.579(P＜0.05)(如图5所示);抗HLA＆MICA抗体MFI值大于1000时与sBAFF呈显著负相关，相关系数r=－0.428(P＜0.05)(如图6所示)。

图5 血清中sBAFF与anti-MICA antibody水平相关性分析Fig.5 Correlation analysis between serum sBAFF and anti-MICA antibody

图6 血清中sBAFF与anti-HLA＆MICA antibody水平相关性分析Fig.6 Correlation analysis between serum sBAFF and anti-HLA＆MICA antibody

图7 血清中miR-338-5p与anti-HLAⅡantibody水平相关性分析Fig.7 Correlation analysis between serum miR-338-5p and anti-HLAⅡantibody

2.6 各抗体MFI值与miR-338-5p的相关性分析血清 miR-338-5p与抗 HLA-Ⅰ类抗体、抗 MICA抗体、抗HLA抗体、抗HLA＆MICA抗体均无显著相关性;采用Spearman法分析所有研究对象血清中miR-338-5p水平与抗HLA-Ⅱ抗体水平的相关性，结果显示miR-338-5p与HLA-Ⅱ呈负相关，相关系数为－0.322(P＜0.05)(如图7所示)。

3 讨论

肾移植术后ABMR主要由受者体内的抗同种供体HLA分子、血ABO同种凝集素或者抗内皮细胞抗体介导的一类排斥反应，是影响移植肾长期存活的重要原因［9-13］。在急性ABMR过程中，高效价的抗体导致补体系统的激活和移植物内皮组织的溶解性损伤。临床症状重，救治困难，对大剂量激素冲击治疗无效，预后很差。慢性ABMR主要表现为慢性移植物肾病(CAN)，尚缺乏理想的治疗方案［13］，目前临床上以支持治疗为主，如以血管紧张素转化酶抑制剂(ACE1)/血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、血脂调节药物等药物治疗。因此进一步探讨ABMR的确切机制具有重要的理论和临床意义。

为了深入研究miR-338-5p与BAFF信号的相关性，及其在ABMR过程中的可能作用，本项研究以随访的肾移植受者为研究对象，结果发现肾移植受者血清miR-338-5p水平显著低于健康组，且不同移植时间组间血清miR-338-5p水平有显著差异;相关性分析显示miR-338-5p水平与sBAFF水平显著负相关。表明miR-338-5p参与肾移植术后机体的某种生理或病理过程，且对BAFF信号具有直接或间接的调控作用。

有报道表明肾移植患者血清sBAFF水平与移植肾功能正常与否有关。如Lehnhardt等［14］研究显示儿童肾移植患者血清中sBAFF水平显著升高、肾小球滤过率小于60 ml/mim的移植患者血清sBAFF显著高于肾功能正常的患者。本项目组前期研究亦发现，在移植肾功能异常的肾移植受者外周血单个核细胞上BAFF水平增高，而sBAFF水平与移植肾功能是否正常没有显著相关性［4］。本组研究得到与前期研究相似的结果(肾移植功能异常组:1495±1392 pg/ml vs肾移植功能正常组:1219±562 pg/ml，P＞0.05)。本组研究中所有参选对象均没有服用过如抗CD20单抗、抗CD52单抗等可能致BAFF水平异常增高的制剂。故可以排除药物原因所致的BAFF水平异常增高。造成与国外研究结果差异的原因尚待深入探究。

由于本组研究是以随访的肾移植患者为研究对象，并没有取得所有参选患者的移植肾活检组织，因而没有能够进一步分析miR-338-5p表达水平与移植肾病理的相关性。但是研究中以肾移植随访患者的移植肾功能是否正常进行分组分析，结果发现，miR-338-5p水平在移植肾功能正常组与异常组间没有显著差异。引起移植肾功能下降的原因包括免疫因素和非免疫因素等多个方面，而只是以移植肾功能是否正常来分组并不一定适合于研究miR-338-5p表达状况。本研究中同时检测了各同种抗体的表达水平，分析了miR-338-5p与sBAFF、及各同种抗体的相关性，结果显示抗同种抗体的产生与sBAFF水平的变化有时间差，抗同种抗体的产生落后于sBAFF水平的变化。提示检测肾移植受者血清sBAFF水平具有警示作用，sBAFF水平增高提示机体产生抗同种抗体的能力增强。同时研究亦显示miR-338-5p与抗HLA-Ⅱ抗体显著负相关，这一结果显示miR-338-5p与抗同种抗体的产生是密切相关的。但以术后3年为界进行分组分析时miR-338-5p与抗同种抗体的相关性分别为(术前3年)负相关、(术后3年)正相关。导致这一结果的原因将在今后的工作中深入探讨。

microRNA是一类长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，主要通过与靶基因的3'-非编码区(3'-Untranslated Regions，UTR)结合来调控靶基因，参与生物体正常发育的调节等重要生命活动过程［15，16］。研究亦已发现，多种microRNAs参与肾移植后抗体介导的排斥和细胞介导的排斥，并且与移植免疫耐受相关［17-22］。

miR-338-5p是长为22个核苷酸的微小RNA。对miR-338-5p的研究相对较少。新近报道，联合检测 miR-338-5p、miR-193a-3p、miR-23a可以有效监测早期直肠癌［23］。而miR-338-5p与肾移植的相关研究目前仅限于本项目组。通过TargetScan和miR-Walk等数据分析平台预测miR-338-5p的靶向调控网络，发现 miR-338-5p具有608个靶基因，包括TRAF3和NF-κB1等。TRAF3是BAFF信号传导的重要转接蛋白，而NF-κB1途径是重要的BAFF信号之一。信息学分析提示，miR-338-5p可能通过靶向作用于TRAF3和 NF-κB1而间接作用于 BAFF信号。靶点验证实验显示，miR-338-5p对TRAF3和NF-κB1均具有靶向调控作用［8］。因而，有关 miR-338-5p与BAFF信号之间的作用关系将在后续工作中深入研究。

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