穴位注射胞二磷胆碱对脑外伤大鼠生长相关蛋白-43表达的影响

郭知学，李鸥，汪春，冯晓梅

脑外伤(traumatic brain injury,TBI)是常见的严重致残性神经系统伤病。脑外伤后遗症的功能障碍包括运动障碍、疼痛、感知和认知障碍、精神/心理障碍等[1]。

穴位注射是在传统的针灸疗法基础上，选择合适的穴位注入适量的液体药物，以防治各类疾病的方法。本实验观察足三里穴位注射胞二磷胆碱对脑外伤大鼠神经功能及神经生长相关蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)的影响，以探讨穴位注射神经营养剂对脑外伤后神经结构蛋白的合成和促进神经再生与神经功能康复中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体质量250～300 g，由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2007-016。注射用胞二磷胆碱钠：闽东力捷迅公司。兔抗鼠GAP-43单克隆抗体：武汉博士德生物工程有限公司。兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 模型制备及分组

采用改良Feeney法[2]复制自由落体脑损伤模型。大鼠术前禁食8 h，禁水2 h。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧固定于脑立体定位仪上。右侧颅顶部备皮，常规消毒铺巾。右侧颅顶旁正中切口，长约3 cm，分离皮肤，切开骨膜，向两侧分离，露出约1×1 cm颅骨，皮下少量出血以电凝止血。以前囟后1.5 mm为中心钻孔，蚊式钳扩大骨窗至4 mm(注意保护矢状窦和保持硬脑膜完整)。将其置于自由落体底部，40 g砝码从25 cm高处滑下，撞击于骨窗之硬膜上，致伤面积1 cm2，下陷深度约2 mm。假手术组(A组)大鼠8只，麻醉后同样皮肤切口、暴露骨窗及缝合，但不进行重力撞击。造模成功大鼠32只用抽签法分为穴位注药组(B组)、穴位注水组(C组)、腹腔给药组(D组)和腹腔注水组(E组)各8只。

1.3 干预方法

胞二磷胆碱粉针以生理盐水溶解为500 mg/ml。足三里穴定位采用拟人比照法，取大鼠后膝关节外下方腓骨小头下约5 mm处，直刺5 mm。

B组以500 mg/kg足三里穴位注射，注射体积0.25～0.3 ml；C组足三里穴注射等体积生理盐水；D组胞二磷胆碱500 mg/kg腹腔注射；E组造模后腹腔注射等体积生理盐水。A组腹腔注射等体积生理盐水。

各组注药、注水均于致伤后30 min开始首次注射，每天1次，连续给药14 d。各组动物于术后28 d处死。

1.4 观测指标及方法

1.4.1 大鼠神经功能缺损评分 各组大鼠分别于术前及术后1 d、8 d、14 d参照Bederson的方法[3]进行神经功能缺损评分：提鼠尾离开地面约30 cm，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，分别从两侧推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察行走情况。采用5级评分法(0～4分)：0分，行为完全正常，步态平稳；1分，提起鼠尾离开地面，非损伤侧前肢内旋、内收；2分，将大鼠置于地面，推动大鼠躯体检查两侧抗力，非损伤侧抗力下降；3分，将大鼠置于地面，观察其行走，只向一侧转圈；4分，无法站立或虽能站立但不能自行行走。

1.4.2 旷场实验(open-field test) 各组大鼠置于40×80×80 cm的方形旷场中，内壁为黑色，旷场底面分成面积相等的25块正方形格。正上方2 m处架一摄像机，镜头对准箱底。室内隔音，大鼠置于方箱底面中心，同时进行摄像和计时。记录动物行为，每次测定时间3 min。以穿越底面的格数作为水平积分，以两前肢同时离地的次数作为垂直积分，两者之和为旷场试验积分[4]。于术前及术后15 d、22 d各测1次。

1.4.3 脑组织免疫组化染色 术后28 d各组大鼠4%多聚甲醛300～500 ml心脏灌注，90 min后断头，取出全脑，4%多聚甲醛固定4 h。常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。损伤区取材切片，片厚10μm，每隔100 μm取1张，每个标本共取6张，取3张行免疫组化染色。

3%H2O2室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶；抗原微波修复；加入兔抗大鼠GAP-43抗体，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加聚合物辅助剂，37℃孵育15 min，PBS冲洗3次；滴加辣根酶标记抗兔IgG多聚体，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；滴加即用型二步法非生物素检测试剂盒中的试剂2；滴加新鲜配制的DAB溶液显色5～10 min，蒸馏水洗涤终止染色，苏木精复染，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗，同步免疫组化染色处理，结果为阴性。

1.4.4 图像分析处理 应用IBAS 2000图像分析系统测定大鼠大脑皮层损伤周围区的光密度值(OD)。每只大鼠脑切片随机选取3个高倍视野(400×)，取平均值；同时测定同一张切片上胼胝体OD值作为背景，损伤周围区OD值减去背景OD值得到校正光密度值(COD)，用于比较分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

术前各组大鼠神经功能缺损评分均为0分。术后，A组神经功能缺损评分均为0分，低于其余各组(P<0.05)。术后1 d造模各组大鼠多为3分：提尾表现为损伤对侧前肢内旋或内收，侧向挤压时损伤对侧抗力减低，多数可以转圈行走，少数大鼠无法站立或行走。术后8 d、14 d，造模各组大鼠评分逐渐下降，B组评分低于另外3组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

2.2 旷场试验

术前，各组大鼠精神状态良好，有较高的活动兴奋性。A组大鼠在整个实验过程中处于平稳状态。术后15 d及22 d，造模各组A组穿越格子数和站立次数减少，旷场试验评分下降(P<0.05)；B组评分高于另外3组(P<0.05)。见表2。

2.3 GAP-43

GAP-43阳性细胞胞浆着棕黄色，主要分布于损伤区周围和大脑皮质的神经细胞。B组GAP-43阳性表达明显多于C组、D组和E组(P<0.05)。见表3。

3 讨论

颅脑外伤治疗中最重要和最困难的是对认知、情感和行为功能障碍的处理[1]。胞二磷胆碱能够促进脑组织代谢，改善脑微循环，兴奋胆碱能神经，在中枢神经系统损伤后的认知功能恢复等方面有效[5-6]。穴位注射若选择的经络、腧穴适当，药物作用出现时间与效果优于肌肉注射，与静脉注射效果相当甚至更佳[7]。我们以往的研究显示，穴位注射胞二磷胆碱对脑外伤大鼠的认知、记忆能力和神经功能均有明显的改善作用[8-9]。

中枢神经系统损伤后轴突自发再生能力十分有限，因此中枢神经损伤后功能恢复一直是神经科学研究的难点之一。近年来，GAP-43已成为学者研究的焦点，关于GAP-43参与中枢神经损伤修复的研究大量展开。

GAP-43是一种神经元特异性蛋白，主要表达于发育或再生轴突的生长锥末端，参与轴突生长、突触重构以及儿茶酚胺和神经肽类物质的分泌[10-11]。在脑功能活跃区表达量很高。大量研究证实，GAP-43的表达与成年动物神经元轴突再生及可塑性密切相关[12]。电针刺激足三里穴能够增加脑梗死大鼠梗死灶GAP-43表达，从而改善脑梗死大鼠神经功能，促进其神经功能重塑[13]。

旷场试验反映大鼠在新环境中探究行为和适应能力的方法[14]，结合神经功能缺损评分，可以反映大鼠行为功能和认知功能的情况。

大鼠脑损伤后，神经功能明显障碍，神经功能缺损评分及旷场试验得分均下降；随着观察时间延长，大鼠功能得到一定恢复，穴位注射胞二磷胆碱组功能恢复优于其他各组。

免疫组化染色显示，造模大鼠在脑损伤后第28天均出现GAP-43表达上调，提示这种蛋白表达在中枢神经系统损伤后重建过程中具有很大潜能；穴位注射胞二磷胆碱可以上调GAP-43蛋白表达，促进脑损伤大鼠神经功能缺损的恢复。

综上所述，穴位注射神经保护剂疗法和GAP-43蛋白表达有望为神经系统损伤等疾病的康复治疗开辟一条新的途径。

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