乳鼠成纤维细胞在人血清中的存活与增殖的研究

肖扬+李裕舒+董平栓

【摘要】 目的：本研究旨在证明人血清直接培养乳鼠成纤维细胞是可行的。方法：将乳鼠成纤维细胞分别在胎牛血清及人血清中培养，通过在显微镜下观察成纤维细胞形态及密度，同时用MTT比色法检测吸光度来对比成纤维细胞在胎牛血清及人血清中的增殖活性。结果：两种实验方法均显示：两组成纤维细胞在第一天的增殖活性无显著性差异，第四天人血清组的成纤维细胞增殖明显比胎牛血清组活跃。结论：乳鼠成纤维细胞在人血清中不仅可以存活，而且有增殖行为。

【关键词】 成纤维细胞； 人血清

Observation on Surviving and Proliferation of Neonatal Rat Fibroblasts in Human Serum/XIAO Yang， LI Yu-shu，DONG Ping-shuan.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：015-017

【Abstract】 Objective： To prove that human serum directly is feasible to culture rat fibroblasts. Method： Rat fibroblasts were cultured in serum and fetal bovine serum， by observing the morphology and density of fibers under a microscope， and with the MTT ratio test to compare the absorbance of cells into proliferative activity in serum and fetal bovine serum. Result： There was no significant difference between two groups in the first day； but the fibroblasts proliferation rate in human serum was higher than in fetal bovine serum. Conclusion： Neonatal rat fibroblasts in human serum can survive and proliferate in human serum.

【Key words】 Fibroblast； Albumin Human

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.005

成纤维细胞是结缔组织中常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，细胞扁平，多突起，呈梭形、三角形、不规则形，它参与人体的纤维化过程。过度纤维化会导致器官形态及功能的异常，心脏的纤维化可导致心脏扩大、心衰、心律失常等[1]，因此心脏纤维化是目前心脏研究的热点。研究过程中常会用到成纤维细胞，但限于成纤维细胞的取材限制，常用实验动物的细胞，多用动物血清培养[2]，但用人血清直接培养的却很少。本研究旨在证明人血清直接培养乳鼠心脏成纤维细胞的可行性，为成纤维细胞在人体中的增殖研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 乳鼠（SD大鼠）；胰酶1：250（Amresco公司生产）；胶原酶B型（Roche公司生产）；DMEM高糖培养基（Gibico公司生产）；噻唑蓝MTT（Sigma公司生产）；二甲基亚砜DMSO（Amresco公司生产）；倒置显微镜（Olympus公司生产，型号IX74 TH4-200）；酶标仪（BIO-TEK公司生产，型号ELX 800）。实验分组：选择胎牛血清组为对照组；选择正常人15例为实验组，年龄（57.0±1.3）岁。

1.2 方法

1.2.1 实验材料处理方法

1.2.1.1 实验血清处理方法及原代培养液制备 将无菌促凝管中抽取的成人动脉血，置于4 ℃温度下1 h，待血液凝固后，离心（3000转/min）10 min，取上清置于离心管中，实验用的胎牛血清从试剂公司购回，在无菌超净台中将其分装至无菌小瓶中看，置于-20 ℃冰箱中冻存备用。每次使用时将其置于室温下完全溶解即可使用。将处理好的人或胎牛血清加入达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基，血清浓度为10%，有研究显示血清浓度为10%～15%时，成纤维细胞生长良好[3]，放置于无菌超净台中用滤膜微孔为0.22微米的一次性滤器滤过除菌，制备成原代培养液，按照100 U/mL的浓度加入双抗（分别将青霉素和链霉素用无菌蒸馏水完全溶解后制成的溶液）以抑制培养过程中细菌的生长，防止细胞被污染，置于-20 ℃冰箱中冻存备用。

1.2.1.2 乳鼠心脏成纤维细胞的分离培养步骤 在超净台中，取乳鼠（出生3 d以内）心脏，剪碎后用双酶消化（2.5 g/L胰酶+1 g/L胶原酶），第一次消化10 min后弃上清，从第二次开始每次消化5 min，将上清转移到含有原代培养液的无菌离心管中，直至将组织消化完毕，离心（1000转/min）10 min，弃上清，加入培养基混匀，分装在50 mL培养瓶中，置于温度为37 ℃，CO2浓度为50 mL/L的培养箱中，两小时后弃去上清，将分离出的成纤维细胞分为二等分，分别用含有胎牛血清和人血清的原代培养液进行培养，隔日换液。每个样本换液均用其原代培养液。体外成纤维细胞在培养容器的典型存活和生长方式是贴壁和增殖，贴壁成纤维细胞在光学显微镜下观察为梭形、三角形或不规则形，有较长的伪足样突起。endprint

1.2.2 实验结果获得方法

1.2.2.1 显微镜下观察步骤：将培养容器放置在倒置显微镜（Olympus公司生产，型号IX74TH4-200）下选择细胞轮廓清晰的视野进行照相记录。

1.2.2.2 检测成纤维细胞增殖的MTT（噻唑蓝）比色法步骤：取生长状态良好的细胞用2.5 g/L的胰酶消化，在显微镜下见细胞变圆，弃去胰酶，加入原代培养液吹打，吹打完毕后转移至无菌96孔板中继续培养，每孔约4000个细胞，200 μL培养液。连续6 d检测结果，检测当天，每孔加入5 ?L MTT，放入温度为37 ℃，CO2浓度为50 mL/L的培养箱继续培养4 h，弃去上清，每孔加入150 ?L的二甲基亚砜，10 min摇匀后，以570 nm为测量波长，在酶联免疫检测仪上测每孔的光吸收值（OD），以不加细胞的空白孔OD值作调零值，并以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制曲线。

1.3 统计学处理 各组计量资料用（x±s）表示，数据分析用配对t检验，统计处理使用软件SPSS 13.0完成，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜（×200）下，成纤维细胞形态结果 传代后，在倒置显微镜（×200）下观察成纤维细胞形态及密度，A、C为FCS所培养，B、D为HFS所培养。第1天两种含不同血清培养基培养的成纤维细胞形态相似，呈梭形或三角形，有较长伪足样突起，且密度大致相同，如图1中A、B所示。第4天两种含不同血清培养基培养的成纤维细胞相似，呈梭形、三角形或不规则形，但密度不同：含FCS培养基培养出的成纤维细胞密度大于含HFS培养基的，见图1中C、D。与第1天相比，每种培养基培养细胞的密度均比同种在第1天观察到的密度大。

2.2 吸光度与时间关系 根据每日检测结果绘制细胞增殖的吸光度与时间关系曲线。（图表中数据为细胞增殖的吸光度值，为各组各样本每天吸光度值的均数。从图中可以看出，两组细胞吸光度均随培养天数的增加呈上升趋势，其中牛血清组的上升趋势快于人血清组，见图2。

图1 第二代成纤维细胞倒置显微镜下形态

图2 细胞增殖的吸光度与时间关系曲线图

2.3 两组吸光度的比较结果 两组吸光度在第1天比较，差异无统计学意义；第4天两组吸光度比较差异有统计学意义，且牛血清组吸光度高于人血清组，见表1。

表1 三组MTT检测细胞吸光度值（x±s）

组别 第1天 第4天

FCS组 0.012±0.010 0.182±0.013△

HFS组 0.008±0.002 0.156±0.033*

*与FCS组相比较，P<0.05；△与HFS组相比较，P<0.05

3 讨论

成纤维细胞是结缔组织中常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。电镜下可看到胞质中有丰富的粗面内质网、游离的多核糖体和发达的高尔基复合体，表明该细胞合成蛋白质的活动旺盛，在正常情况下，这种细胞多处于静止状态，功能活动不活跃，成为纤维细胞，而在创伤等条件下可被炎症介质趋化，进入增殖活化状态，成纤维细胞可以合成和分泌弹性纤维、网状纤维等细胞外基质成分[4]，同时还可合成和分泌金属蛋白酶及其抑制剂，间接参与旧胶原的降解和新胶原的重排、沉积，参与受损组织的纤维性修复即纤维化过程，然而，过度的纤维化使器官及组织丧失原有的形态或功能[5-6]。因此，纤维化的发生发展成为研究的热点，成纤维细胞成为该类研究不可或缺的研究部分，心脏纤维化是目前心脏疾病研究的热点，心脏的纤维化不仅能造成心脏结构、功能的异常，导致心脏扩大进而出现心力衰竭[7]，也由于心脏成纤维细胞的电生理学特性造成心律失常[8]，由于在人类活体上获取心脏组织细胞有一定难度，而且可能会对受试者造成不可知的伤害，因此本研究选取出生3 d以内的乳鼠心脏作为成纤维细胞的来源器官，利用在同一培养皿中心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间的不同分离出心脏成纤维细胞[9]。目前的科学研究中，多用动物血清来培养细胞，其培养的细胞存活率较高、分裂增殖活动比较活跃[10]，而关于成年动物血清尤其是人类血清培养的成纤维细胞是否出现类似现象的研究甚少，而选择人类血清直接培养细胞要比动物血清培养细胞之后再进行相关的干预更具说服力。

在倒置显微镜下，成活的乳鼠心脏成纤维细胞呈梭形、三角形或不规则形，细胞质透明、向外伸出突起呈伪足样，细胞核大，呈椭圆形，无自发性搏动，显微镜下可直接看到成活乳鼠成纤维细胞的形态及密度。MTT比色法是一种常用的检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm或570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。

本研究将人血清和胎牛血清培养乳鼠心脏成纤维细胞的结果进行对比，第1天镜下观察到的含两种不同血清培养基培养的成纤维细胞密度无明显差异（见图1的A、B）且MTT结果中吸光度无显著差异（见表1），说明第1天时成纤维细胞处在一个适应过程，到第4天时每种培养基培养细胞的密度均比同种在第1天观察到的密度大（见图1的C、D），且在培养的头4天，MTT结果显示吸光度都随时间呈增长趋势（见图2），这说明两种培养基培养的成纤维细胞均已存活，且有数量上的增加，即有分裂增殖行为。在第二代细胞培养第4天以后，两种不同培养基培养的成纤维细胞经MTT法检测的吸光度都有下降的趋势，提示成纤维细胞的数量有所下降，这可能跟培养的空间有限，限制了细胞的增殖。综合以上镜下观察以及MTT吸光度的结果可以发现，乳鼠心脏成纤维细胞在胎牛血清培养基中可存活并分裂增殖，在人血清培养基中显示了同样的趋势。对比两组结果，成纤维细胞在胎牛血清中生长更为活跃，可能与胎牛血清中含有更多的刺激细胞生长的细胞因子有关。实验证明，乳鼠心脏成纤维细胞不仅可在人血清中存活，且有增殖行为，乳鼠成纤维细胞直接由人血清培养是可行的。虽然该实验选取心脏成纤维细胞作为研究对象，但因成纤维细胞在动物各个器官广泛存在，且生物学特性类似，故人血清直接培养其他器官来源的成纤维细胞亦是可行的，该研究为人类血清培养动物细胞的可行性提供了依据。endprint

参考文献

[1]马金，丁春华.心脏成纤维细胞与心肌纤维化[J].中华心血管病杂志，2014，42（3）：269-272

[2]刘爱旗，夏璐.CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究[J].中国医学创新，2013，10（2）：12-13.

[3]刘鹏，金岩，刘源，等.不同种属真皮成纤维细胞在不同血清浓度培养基中生长的比较观察[J].实用口腔医学杂志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢晓倩，徐健，苏浩，等.犬心房颤动模型缝隙连接蛋白40、45与心肌纤维化的相关性[J].中华心血管病杂志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吴刚，何辉，曹月诚，等.不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文编辑：王宇）endprint

参考文献

[1]马金，丁春华.心脏成纤维细胞与心肌纤维化[J].中华心血管病杂志，2014，42（3）：269-272

[2]刘爱旗，夏璐.CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究[J].中国医学创新，2013，10（2）：12-13.

[3]刘鹏，金岩，刘源，等.不同种属真皮成纤维细胞在不同血清浓度培养基中生长的比较观察[J].实用口腔医学杂志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢晓倩，徐健，苏浩，等.犬心房颤动模型缝隙连接蛋白40、45与心肌纤维化的相关性[J].中华心血管病杂志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吴刚，何辉，曹月诚，等.不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文编辑：王宇）endprint

参考文献

[1]马金，丁春华.心脏成纤维细胞与心肌纤维化[J].中华心血管病杂志，2014，42（3）：269-272

[2]刘爱旗，夏璐.CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究[J].中国医学创新，2013，10（2）：12-13.

[3]刘鹏，金岩，刘源，等.不同种属真皮成纤维细胞在不同血清浓度培养基中生长的比较观察[J].实用口腔医学杂志，2004，20（1）：16-19.

[4] Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J]. J Pathol，2008，214（2）：199-210.

[5] Brown J J， Bayat A. Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J]. Br J Dermatol，2009，161（1）：8-18.

[6] Juckett G， Hartman-Adams H. Management of keloids and hypertrophic scars[J]. Am Fam Physician，2009，80（3）：253-260.

[7] Li Y Q， Li X B， Guo S J， et al. Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensin Ⅱ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34（3）：352-359.

[8]邢晓倩，徐健，苏浩，等.犬心房颤动模型缝隙连接蛋白40、45与心肌纤维化的相关性[J].中华心血管病杂志，2011，39（2）：176-180.

[9] Golden H B， Gollapudi D， Gerilechaogetu F， et al. Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J]. Methods Mol Biol，2012，843（1）：205-214.

[10]吴刚，何辉，曹月诚，等.不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（49）：9151-9154.

（收稿日期：2014-03-24） （本文编辑：王宇）endprint