云南切梢小蠹微卫星的高通量发掘

袁 远，张丽芳，吴国星，朱家颖

(1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201;2.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，昆明 650224)

微卫星(microsatellite)又称简单序列重复或短串联重复，是指以1-6个核苷酸为重复单位串联组成的重复序列，由Miesfeld (1981)等在1981年首次发现。它们主要以2-3个碱基重复类型为主，广泛分布于原核生物以及真核生物基因组中(崔建洲等，2006;史洁等，2012)。微卫星不仅具有丰富的多态性、高度的杂合性和良好的稳定性，而且遵循孟德尔分离定律，呈现共显性遗传，具有容易操作和检测等优点(宋来鹏等，2008;张俊娥，2012)。因此，该标记已被广泛应用于基因组遗传连锁图构建、基因定位与克隆、分子标记辅助育种、种群遗传多样性分析和家系识别等领域(Beheregaray et al，2003;Hadonou et al.，2004)。

云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis (Coleoptera:Scolytinae)是危害云南松Pinus yunnanensis的主要次期性蛀干害虫，其在云南红河、楚雄、曲靖、玉溪、安宁、昆明等多地州县市猖獗危害，且近年来呈现扩大和蔓延的趋势 (牛明德和卢南，1992;Kikendall et al.，2008)。因该害虫具有危害隐蔽、危害期长、防治困难等特点，对当地生态环境造成了严重破坏，并造成了巨大的经济损失(李丽莎等，1997)。迄今，有关该害虫的研究，主要集中在生物学、生态学以及防治措施等领域，甚少有关遗传背景和分子生物学方面的研究(闫争亮等，2011)。有鉴于此，本文基于已构建的云南切梢小蠹转录组数据库，对其微卫星进行了高通量发掘，旨在为今后研发高多态性微卫星引物，对该害虫进行种群遗传结构、种群遗传多样性、功能基因组学等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 转录组数据

云南切梢小蠹转录组数据采用二代测序技术构建获得(Zhu et al.，2013a)，有关数据全部提交到DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)数据库中，登录号为DRA000917。

1.2 微卫星筛选

利用M1SA 软件(Micro Satellite) (http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对转录组数据库序列中的微卫星进行筛选，筛选标准为:单核苷酸重复的次数在12 次或12 次以上，二核苷酸重复的次数在6 次或6 次以上，三和四核苷酸重复的次数在5 次或5 次以上，五和六核苷酸重复的次数在4 次或4 次以上，并且两个相邻微卫星重复单元之间的最小长度设为100 bp。

2 结果与分析

2.1 微卫星重复单元的种类和数目

从构建的云南切梢小蠹转录组数据库中，获得84899 条基因序列，长为32595681 bp。这些基因序列经M1SA 软件搜寻，共得到1098个微卫星序列，占总搜寻基因序列总数的1.29%，平均每29686 bp 中就存在1个微卫星。

在发掘获得的微卫星中，不同重复单元的数目如表1 所示。其中，三核苷酸微卫星重复单元有482个，占重复单元总数目的43.90%;其次是单核苷酸微卫星重复单元，有420个，占总数目的38.25%;再次是二、四和五核苷酸微卫星重复单元，分别为169、12 和12个，分别占总数目的15.39%、1.09%和1.09%;最少的是六核苷酸的微卫星重复单元，仅有3个，占总数目的0.27%。

表1 云南切梢小蠹转录组中不同长度重复单元微卫星所占比例Table 1 Frequency of microsatellites based on the number of repeat units in Tomicus yunnanensis transcriptome

2.2 微卫星不同重复单元的分布

云南切梢小蠹不同重复单元的分布情况较为丰富，如表1 所示。单核苷酸重复单元中，重复次数最多的是14 次，为156个;二核苷酸重复单元中，重复次数最多的是6 次，为95个;三核苷酸重复单元中，重复次数最多的是大于5 次，为364个;四核苷酸重复单元中，重复次数最多的是5 次，为11个;五核苷酸重复单元中，重复次数最多的是4 次，为11个;六核苷酸重复单元中，重复次数最多的为4 次，为2个。在六种核苷酸重复单元中，重复次数最多的是5 次，为386个，占微卫星总数的31.60%;重复次数排第二的是6 次，为190个，占微卫星总数的16.94%;重复次数最少的是10 次，为6个，仅占微卫星总数的0.18%。

2.3 微卫星不同重复类型的分布情况

云南切梢小蠹微卫星不同重复类型的分布情况如表2 所示。在A/T 和C/G 两种单碱基重复类型中，优势重复单元为A/T，为367个，占微卫星总数的33.42%，重复次数最多的是12 次，为142个。在AC/GT、AG/CT、AT/AT 和CG/CG 四种二碱基重复类型中，优势重复单元为AT/AT，为67个，占微卫星总数的6.10%，重复次数最多的是6 次，为45个。在AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATT、ACC/GGT、ACG/CGT、ACT/AGT、AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG 和CCG/CGG 十种三碱基重复类型中，优势重复单元为AAT/ATT和ATC/ATG，都为83个，占微卫星总数的7.56%，重复次数最多的都是5 次，分别为49 和48个。AAAT/ATTT 四碱基重复单元为6个，占微卫星总数的0.55%，重复次数最多的是5 次，为5个。其它碱基重复单元为21个，占微卫星总数的1.91%，重复次数最多的是4 次，为13个。

表2 云南切梢小蠹转录组中不同重复类型微卫星所占比例Table 2 Frequency distribution ofmicrosatellites based on motif sequence types in Tomicus yunnanensis transcriptome

3 结论与讨论

以往微卫星的发掘主要是通过构建微卫星富集文库，然后对文库进行大规模测序获得，这种方法虽然有效，但一般较为耗时并需要大量资金(Arthofer et al.，2011)。随着基因组学技术的发展，人们现在已经可以通过已经测通的基因组，对一些物种的微卫星进行高通量发掘，但这些研究仅限于基因组学被测通的物种 (Lovin et al.，2009)。近年来，随着二代测序技术的发展，诸多物种的转录组数据库已被构建，不少学者正试图基于转录组数据库高通量筛选微卫星(Bai et al.，2011;Zhu et al.，2013b)。本研究基于先前构建的云南切梢小蠹转录组数据库，发掘获得了1098个微卫星，其中平均29686 bp 中就有一个微卫星，占整个转录组数据库基因序列的1.29%。这一比例比其他昆虫基于全基因组数据鉴定获得的微卫星比例小，应该是由于转录组数据量远比全基因组数据量少的原因(Archak et al.，2007)。但是，研究结果表明转录组数据是有效高通量发掘微卫星的有效方法之一。在鉴定获得的云南切梢小蠹微卫星中，与其它研究结果相似，三核苷酸重复序列的数目是最高，为最主要的核苷酸重复序列(Xu et al.，2012)。而且，以往的研究证明，三碱基重复单元出现假阳性现象很少，是较好的引物开发资源(张俊娥，2012)。在核苷酸重复单元中，重复次数最多的是5 次，占微卫星总数的31.60%。Smulders (1997)认为，重复次数多的微卫星既能在种间又能在种内产生丰富的多态性。为此，虽然一些重复次数多的重复单元占有的比例不大，但有很大的可能性被开发为有效微卫星分子标记。这些微卫星的获得，为今后开发高多态性微卫星引物来研究云南切梢小蠹种群遗传结构、种群遗传多样性、功能基因组学等具有重要意义。

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