内蒙古11 种主要草原蝗虫16S rDNA 序列分析

张敏哲，周晓榕，庞保平，韩海斌

(内蒙古农业大学草地昆虫研究中心，呼和浩特 010019)

蝗灾是一种世界性生物灾害，全世界发生蝗灾的面积达4680 万km2，全球1/8的人口常受到蝗灾的袭扰。全世界已发现蝗虫1 万多种，我国已知有900 多种，为害较严重的有30 多种(陈永林，2007)。内蒙古草原是欧亚大陆草原的重要组成部分，是我国北方温带草原中最具代表性的植被类型，约占我国天然草原面积的1/4，也是我国北方重要的生态屏障。蝗虫是内蒙古草原生态系统的重要组成部分，已鉴定95 种，隶属于5 科40属(马耀等，1991)。但目前关于内蒙古草原蝗虫系统进化关系的研究却不多见。

线粒体DNA (mtDNA)为细胞核外遗传信息载体，具有共价闭合环形双链结构，结构较简单，分子质量小等特点。一般认为，mtDNA 中的16S rDNA基因较保守，其进化速率慢，适合较高分类单元的系统发育进化的研究，是常用线粒体分子标记，可用于属、种间系统发育分析(陈爱辉和蒋国芳，2004;Nagaraja et al.，2004;Marquez et al.，2007)。Flook 和Rowell (1997)最早应用mtDNA 中12S 和16S rDNA 序列研究了直翅目蝗虫的系统发育关系，随后16S rDNA 序列被广泛地应用于直翅目昆虫的系统发育关系研究(印红等，2003;胡靖等，2004;刘殿锋等，2005;Lu et al.，2006;孙正莉等，2006;崔爱明等，2012)。近年来，为了更好地揭示昆虫的系统发育关系，有学者开始将16S rDNA 序列结合其他基因序列共同分析蝗虫的系统发育关系，如Gómez 等(2012)结合3个线粒体基因:细胞色素c 氧化酶亚基II、16S rRNA 和12S rRNA 基因，研究了北美的直翅目蝗科带翅蝗虫属Encoptolophus的系统发育关系。本文测定了内蒙古11 种主要草原蝗虫线粒体16S rDNA序列，构建了其系统发育树，以期为揭示内蒙古草原蝗虫的系统发育关系提供必要的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试蝗虫种类、采集地点及时间见表1。

表1 供试样本信息Table 1 Information on test samples

1.2 实验方法

1.2.1 蝗虫基因组DNA 提取

采用天根dp304 动物基因组试剂盒提取提取蝗虫后足股节肌肉DNA。将DNA 统一稀释到50 ng/μL，用做PCR 扩增，在-20℃冰箱中保存备用至PCR 扩增。

1.2.2 PCR 扩增反应体系和反应条件

PCR 扩增引物设计参照Emerson 等经过修订的16S 基因通用引物，本研究所用引物为:上游引物:5'-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3';下游引物:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

在50μL的PCR 扩增反应体系中包括:DNA模板2μL、10× PCR Buffer5μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each) 4μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、TaKaRa Taq (5 U/μL)0.6μL (大连宝生物工程有限公司)、ddH2O 补足至50μL。

扩增条件为94℃预变性3 min;35个循环的94℃变性45 s，59℃复性30 s，72℃延伸1 min;72℃延伸7 min;4℃保温。PCR 仪为BIO-RAD。

1.2.3 扩增产物检测

扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶中加入4μL 核酸染料，电泳条件为100 V/30 min，在紫外检测仪上观察照相。观察得到条带整齐，明亮，无杂带，达到实验用标准，将PCR 产物送到生物公司测序，共送去55个样品。

1.2.4 产物序列测定与序列分析

委托上海生物工程有限公司对PCR 产物进行测序，结果序列与Genbank 中已知蝗虫的16S 序列对比得到496 bp-525 bp的16S 序列，使用DNAsp 软件计算遗传分化系数 FST;使用MEGA4.0 软件对蝗虫的16S 序列进行比较分析，分别计算其碱基含量，遗传距离，选取基于Kimura-2-Parameter 双参数模型 (Kimura，1980)，根据遗传距离采用 NJ、ME、MP 及UPGMA 聚类法构建系统进化树同时用Bootstrap 1000 次检验系统树中各分支的置信度(Felsenstein，1985)，来推演系统发生关系。

2 结果与分析

2.1 PCR 结果分析

通过退火温度梯度实验，寻找最适的退火温度，引物的退火温度梯度为:43℃，44.1℃，46℃，48.9℃，52.7℃，55.7℃，57.7℃，59.0℃。通过退火温度梯度实验优化退火温度后在紫外检测仪上看到的明亮整齐的PCR 条带。PCR 扩增产物电泳总是产生大小相同的一条带，根据MARKER 计算条带的分子量在500-700 之间，没有出现杂带(图1)，说明不存在假基因的干扰，PCR 反应灵敏，引物特异性好，能用于测序分析。

图1 蝗虫16S rDNA PCR 图Fig.1 PCR results of grasshopper 16S rDNA

2.2 数据描述

2.2.1 序列组成

线粒体DNA 16S rDNA 基因片段，PCR 扩增产物测序得到500 bp 左右，对序列进行剪辑，剪切得到505 bp。采用MEGA 中的统计软件计算它们的碱基平均含量分别为:T 38.6%、C 12.2%、A 31.2% 及 G 18.1%;序列中 G+C 含量为:30.2%，A+T 含量为:69.8%;11 种蝗虫在16S rDNA基因片段序列上表现出A/T 偏向性。在505 bp个碱基中检测到156个多态性位点，占碱基总数的30.9%。156个多态性位点中包括50个单变异多态性位点，占总位点数的32.1%，和106个简约信息位点，占总位点数的67.9%。

2.2.2 遗传分化系数

遗传分化系数FST(F-statistic)可以有效反映种间的遗传分化程度。由表2 可知，各种间的遗传分化系数在0.0000-0.9927 之间。黄胫异迦蝗与宽须蚁蝗之间遗传分化系数最高(0.9927)，其次为宽须蚁蝗与鼓翅皱膝蝗(0.9890)，再次为黄胫异痂蝗与毛足棒角蝗(0.9888)。黄胫异痂蝗与红翅皱膝蝗、黄胫异痂蝗与鼓翅皱膝蝗之间以及红翅皱膝蝗与鼓翅皱膝蝗之间的FST值均为0，说明它们之间的亲缘关系最近。

2.3 系统发育树

根据得到的11 种蝗虫序列，结合Genbank 中6个已知序列的蝗虫 (网翅蝗科:白纹雏蝗Chorthippus albonemus、东方雏 蝗 Chorthippus intermedius、浦氏竹 蝗 Ceracris pui、红股竹 蝗Ceracris versicolor;斑翅蝗科:云斑车蝗Gastrimargus marmoratus 和飞蝗Locusta migratoria)，采用NJ、ME、MP、UPGMA 4 种聚类方法构建17 种不同蝗虫mtDNA 16S rDNA 序列分子系统树(图2)。4 种分子系统树得到的结果基本一致，表明，槌角蝗科、斑腿蝗科与网翅蝗科3个科的蝗虫先聚在一

起，再与斑翅蝗科相聚。4 科的17 种蝗虫可以聚为6支。第1支为，网翅蝗科雏蝗属的白纹雏蝗和东方雏蝗聚在一起再与槌角蝗科的毛足棒角蝗和宽须蚁蝗相聚;网翅蝗科竹蝗属的浦氏竹蝗和红股竹蝗聚为第2支;斑腿蝗科的短星翅蝗和黑腿星翅蝗聚为第3支;网翅蝗科的宽翅曲背蝗为第4支;斑翅蝗科的亚洲小车蝗、云斑车蝗和东亚飞蝗聚为第5支;斑翅蝗科痂蝗亚科皱膝蝗的鼓翅皱膝蝗和红翅皱膝蝗相聚与同一亚科的白边痂蝗相聚再与聚在一起的异痂蝗亚科的黄胫异痂蝗和轮纹异痂蝗相聚为第6支。UPGMA 法将同一亚科的东亚飞蝗和云斑车蝗先聚在一起再与亚洲小车蝗相聚，另外3 种聚类方法都将亚洲小车蝗与东亚飞蝗先聚在一起;ME 聚类法将斑腿蝗科的两种蝗虫与网翅蝗科分开。MP 聚类法显示，宽须蚁蝗与网翅蝗科雏蝗属的两种蝗虫的亲缘关系近于毛足棒角蝗，与其他3 种聚类法不同。

表2 11 种蝗虫的遗传分化系数FSTTable 2 The genetic differentiation coefficient of 11 kinds of locusts FST

图2 17 种蝗虫的系统树Fig.2 Dendrogram of 17 grasshopper species

3 结论与讨论

昆虫mtDNA 序列是研究种属间系统发育较好的分子标记。一般认为线粒体16S rDNA 是动物种内个体间较为保守的序列，适合于高级分类单元起源的探讨(Kambhampati et al.，1996;Flook et al.，1999;Hebsgaard et al.，2004)。本文聚类结果表明，槌角蝗科、斑腿蝗科与网翅蝗科3个科的蝗虫先聚在一起，再与斑翅蝗科相聚，一般情况均为相同属的蝗虫相聚，再与同一亚科的蝗虫聚在一起，但是网翅蝗科除外，聚类结果发现，网翅蝗科雏蝗属两种蝗虫与槌角蝗科的毛足棒角蝗和宽须蚁蝗的关系较近，网翅蝗科竹蝗属两个种与斑腿蝗科的短星翅蝗和黑腿星翅蝗的关系较为接近，而网翅蝗科的宽翅曲背蝗单独聚为一支，与同科的其他种亲缘关系较远。4 种聚类方法得到的聚为结果基本一致，其中只有UPGMA 法将同一亚科的东亚飞蝗和云斑车蝗先聚在一起再与亚洲小车蝗相聚，所以本文中使用UPGMA 聚类结果与传统的基于形态特征的蝗总科分类体系更为接近。

关于蝗虫主要科及亚洲小车蝗的亲缘关系，目前的研究结果不甚一致。本文结果表明，槌角蝗科、斑腿蝗科与网翅蝗科3个科的蝗虫先聚在一起，再与斑翅蝗科相聚。任竹梅等(2002)和印红等(2003)分别应用mtDNA cytb 和16S rDNA序列对蝗总科部分种类系统发育关系进行了研究，结果表明槌角蝗科先与网翅蝗科相聚，再与斑腿蝗科相聚，再与斑翅蝗科相聚。韩海斌等(2013)应用rDNA-ITS2 序列研究结果表明，槌角蝗科先与网翅蝗科相聚，再与斑翅蝗科相聚，最后与斑腿蝗科相聚。本文结果表明，亚洲小车蝗与同科的飞蝗和云斑车蝗亲缘关系最近。高书晶等(2010)应用RAPD的研究结果表明，亚洲小车蝗与同科的白边痂蝗亲缘关系最近，但与同科的红翅皱膝蝗和鼓翅皱膝蝗亲缘关系较远。韩海斌等(2013)表明，亚洲小车蝗与同科的其他5 种蝗虫亲缘关系均较远。

综上所述，有关蝗总科的系统发育关系以及网翅蝗科所属蝗虫的分类地位，还有待于今后进一步的研究。

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