京冀地区蔬菜叶螨优势种类鉴定

王少丽，张友军，吴青君，谢 文，徐宝云

(中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

叶螨属于蛛形纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是农业生产上的重要害螨，为害寄主繁多，包括蔬菜、果树和棉花Gossypium spp.、小麦Triticum aestivum Linn.等重要农作物，其中在蔬菜寄主中，主要喜食茄子Solanum melongena、菜豆Phaseolus vulgaris、黄瓜Cucumis sativus Linn、番茄Lycopersicon esculentum Mill.、苋菜Amaranthus mangostanus L.、水芹Oenanthe javanica (Blume)和莲藕Nelumbo nucifera G.等作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时叶片干枯脱落，甚至整株死亡，极大地影响蔬菜的产量和品质。

蔬菜叶螨种类很多，根据以往报道，主要包括截形叶螨Tetranychus truncatus Ehara、朱砂叶螨T.cinnabarinus (Boisduval)、二斑叶螨T.urticae Koch (赵玉伟等，2006;张美淑等，2009;王少丽等，2010)、神泽叶螨T.kanzawai Kishida、土耳其斯坦叶螨T.turkestani (Ugarov et Nikolski)和敦煌叶螨T.dunhuangensis Wang 等。其中截形叶螨、朱砂叶螨和二斑叶螨分布广泛，它们有时单独发生，有时混合发生。神泽叶螨也可在茄子、辣椒等蔬菜上为害，但报道较少;而土耳其斯坦叶螨和敦煌叶螨则地域性强，分别在新疆和甘肃等地发生(牙森·沙力等，2007)。由于叶螨体型微小，部分种类非常相似，肉眼识别困难，长期以来很多研究者认为蔬菜上发生危害的红色叶螨(红蜘蛛)主要是朱砂叶螨(刘映红等，1995;吴千红等，1996;王少丽等，2010;卢永宏和杨群芳，2010)，很多教科书也把朱砂叶螨列为蔬菜作物上的优势害螨。化学防治仍是目前生产上防治叶螨的主要方式，不同种类叶螨对杀螨(虫)剂的敏感度存在显著差异 (van Leeuwen et al.，2010)，据报道，二斑叶螨对杀虫剂的敏感度比朱砂叶螨或截形叶螨低了4-5 倍，且二斑叶螨具有抗药性发展基础的众多的解毒酶基因 (Grbic et al.，2011)。因此，防治叶螨首先要弄清楚寄主作物上的叶螨优势种类，然后针对用药，达到高效防治的目的。

随着我国各地蔬菜栽培制度的巨大变化，目前蔬菜作物上发生为害的叶螨种类亟需进一步鉴定明确。为了实现对蔬菜作物叶螨的高效防治，作者于2009-2013年采用定点和非定点方法采集了北京和河北局部地区的蔬菜叶螨成螨，室内采用形态学分类及分子生物学鉴定技术进行种类鉴定，研究结果将对进一步明确蔬菜叶螨的种类、叶螨的针对性科学防治及不同种类叶螨的生物学研究等工作奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 叶螨样品定点采集

叶螨定点采集点为茄子 (品种为“圆杂16号”)田，地点在中国农科院蔬菜花卉研究所位于北京市海淀区的试验基地。采集田块为面积为200 m2的塑料大棚。田间进行常规农事管理，未施用任何杀虫剂。

2009-2013年连续5年分别于6月中旬采集塑料大棚茄子上叶螨样品，采集方法为:随机取样10 株，每株选取中上部叶片上10 头叶螨，混合为一个样本。一半活体用于形态学鉴定，剩余部分叶螨保存在70%酒精中，之后存于-20 °C 冰箱中备用。

1.2 叶螨样本非定点采集

2009-2013年连续5年分别于北京海淀区、昌平区、河北张家口、廊坊等地随机采集田间不同蔬菜寄主上的叶螨雄性成螨和雌性成螨，特别注意增加雄性叶螨的采集数量，各样品的采集时间、寄主植物和栽培模式各不相同，采集的叶螨一部分用于形态学鉴定使用，剩余部分样品放入70%酒精中，保存在-20 °C 冰箱中备用。详见表1。

1.3 叶螨鉴定方法

1.3.1 形态学鉴定

叶螨样本在实验室内进行显微镜初判断，之后将体色为红色的叶螨样品进行形态学及分子生物学鉴定。2009年、2010年采集叶螨样本由日本茨城大学应用昆虫和动物实验室的叶螨分类专家Tetsuo Gotoh 教授帮助鉴定，2011-2013年采集的叶螨样本送交南京农业大学植物保护学院的洪晓月教授的实验室进行鉴定。每批次标本至少采用10 头雄成螨、10 头雌成螨进行，均采用雄性成螨的外生殖器制作玻片，结合雌成螨的体色进行形态学观察和种类确定，鉴定方法与崔玉楠等(2013)的方法一致。

1.3.2 分子生物学鉴定

采用纯净水对酒精内保存的叶螨样品冲洗之后，采用北京百泰克生物技术有限公司的DNA 提取试剂盒(溶液型)进行单头叶螨的DNA 提取，具体方法参照说明书进行。引物设计及种类鉴定的具体方法参照王少丽等(2013)建立的截形叶螨的种类特异性SCAR 分子标记(上游引物Fw:5'-GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'和下游引物Rv:5'-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3')及其扩增程序进行。

2 结果与分析

2.1 叶螨种类鉴定

采集的叶螨种类于室内进行显微镜观察和初步的形态学鉴定后，根据雌成螨的体色，所采集样本分为两个体色组:红色组和黄绿色组(图1)。黄绿色组叶螨雌成螨为黄绿色，体躯两侧各有一块黑斑，其外侧三裂，内侧接近体躯中部呈现横“山”字形，雄性螨与雌成螨体色相同，体躯末端尖削，因此确定为二斑叶螨(洪晓月等，2012)，仅对红色体色的叶螨进行雄性外生殖器和分子生物学方法鉴定。对单头红色叶螨雄性外生殖器制作切片后显微镜下比较，发现其雄性成螨阳茎端锤微小(直径1.5μm)，端锤背缘平截状，末端1/3 处有一轻微凹陷，近侧突起圆钝，远侧突起尖利，结合雌成螨的体色，鉴定为截形叶螨(图2)(洪晓月等，2012)。

图1 采集叶螨的黄绿色(左)和红色雌成螨(右)Fig.1 Yellow-green (Left)and red spider mite (Right)female adult collected in this study

图2 红色叶螨雄性成虫的阳具(100×)Fig.2 The aedeagus of male spider mite

同时，采用上述SCAR 分子标记对叶螨试虫的基因组DNA 进行PCR 扩增，扩增结果见图3。由图3 可以看出，所有红色组叶螨个体均出现一条303 bp的DNA 条带，而黄绿色个体和清水作为模板的空白对照中未出现明显条带，该引物对是截形叶螨的特异性引物对，对叶螨属的其它种(二斑叶螨、朱砂叶螨、山楂叶螨、柑橘全爪螨及土耳其斯坦叶螨等)的扩增均未出现任何条带(王少丽等，2013)，由此证明所采集样品中红色体色的叶螨均为截形叶螨。

图3 SCAR 标记引物对叶螨种类的PCR 鉴定Fig.3 PCR identification for the species of spider mite using SCAR primers

2.2 叶螨种类鉴定结果统计

定点调查年份内于每年6月份定点采集叶螨进行鉴定，结果表明，连续5年所采集样品均为截形叶螨，说明调查地茄子叶螨的优势种类为截形叶螨(表1)。

非定点调查地点设在北京和河北部分地区(表1)。鉴定结果表明，2009-2011年间采集地点无论茄果类蔬菜或者豆类蔬菜，叶螨优势种类均为截形叶螨，未见朱砂叶螨、二斑叶螨或者其它叶螨种类。而2012年度除了定点调查中海淀区塑料大棚内仍为截形叶螨外，其它调查点则发生了变化。北京海淀区温室茄子上为二斑叶螨，同期昌平区露地栽培的茄子田调查初期(5月份)主要为二斑叶螨 (97.14%)，有少量截形叶螨(2.86%)，6月份严重为害时期叶螨种类组成相似，以二斑叶螨(96.67%)为主，少量为截形叶螨(3.33%)，而2013年所采集温室茄子上叶螨全部为二斑叶螨(表2)，说明所调查温室和露地茄子田中二斑叶螨是优势种类。

表1 北京和河北部分地区叶螨采集信息及优势种类鉴定结果Table 1 Sampling information and identification results of spider mites collected in some areas in Beijing and Hebei

3 结论与讨论

叶螨是蔬菜作物上的重要害螨，其种类多，田间常混合发生。本研究采用形态学鉴定与分子生物学鉴定技术结合，对采集自北京和河北部分地区的蔬菜叶螨进行种类调查与鉴定，结果表明截形叶螨和二斑叶螨是北京和河北部分地区蔬菜作物上的优势叶螨种类，所采集叶螨样品中未见到朱砂叶螨或者其它叶螨种类，与以往研究中朱砂叶螨一直位属常见蔬菜作物优势种类的观点(刘映红等，1995;吴千红等，1996;卢永宏和杨群芳，2010;王少丽等，2010)不一致。可能存在如下原因:第一，叶螨体型微小，存在变异，形态鉴定非常困难，部分研究者仅根据自己的常规认识或者文献所述来进行种类判别，可能存在部分的误判，正如de Mendonça 等(2011)分析GenBank 中不同叶螨的DNA 序列时，发现叶螨属的二斑叶螨、朱砂叶螨、神泽叶螨和截形叶螨最易被误判;而在最近研究中，朱砂叶螨还被称为二斑叶螨的红色型(red type)来进行描述(Sun et al.，2012)，进一步说明朱砂叶螨种的界定尚需要进一步研究;第二，由于采集地点的样本数及采集地域有限，可能以朱砂叶螨为害为主的寄主、地点和发生时期尚未采集到，未来应加大采集区域、寄主植物等进行更多样本的检测;第三，叶螨不同种类同域发生，不同种类之间可能存在种间竞争，竞争取代的结果导致了目前的种类分布。研究发现在菜豆寄主上，二斑叶螨比朱砂叶螨的竞争力更强，但在棉花寄主上，朱砂叶螨比二斑叶螨的竞争力更强 (李亚和程立生，2009;2011)。然而，截形叶螨和二斑叶螨、朱砂叶螨彼此之间的竞争力如何尚不明确。但很显然，不同种类之间竞争力长期发展会导致不同种类之间的演替。

本研究结果表明，即使同在北京市海淀区，采集叶螨的温室和大棚之间距离约100 m，但是温室和大棚茄子上的叶螨优势种类却不同(分别为二斑叶螨和截形叶螨)，说明栽培模式及其周边环境可能对叶螨种类存在一定程度的影响。因此，下一步研究中，我们需要在上述栽培模式下，进一步加大蔬菜叶螨种类的采集地点和寄主作物的种类，这样才可能在更广泛和代表性意义上明确蔬菜叶螨的主要种类。

不同地点叶螨种类的差异除了与地区、寄主、栽培模式等因素有关外，可能还会受到其它因子的影响。本研究发现2012年度北京昌平区露地茄子田邻近果园，据分析果园中的二斑叶螨在此地区越冬数量可能相对较多，温度合适时首先迁入附近的杂草和菜田进行为害，因此茄子田最早发现的零星叶螨仅是二斑叶螨，而后5月份和6月份中都采集到了极少量的截形叶螨，比例约在1.02%-9.04%之间，可能是由附近杂草或者其它作物田中迁入过来。另外，2012年度北京海淀区大棚内的茄子和昌平区露地茄子同是“圆杂16号”品种，但大棚内是截形叶螨，而我们在春季茄子定植初期，发现茄子棚周边的杂草灰灰菜很多，而灰灰菜上已开始零星发现截形叶螨，因此，推测当茄子苗定植后，截形叶螨很可能是由周边杂草灰灰菜上的叶螨迁入形成种群。同时，叶螨不同种类之间存在竞争，首先迁入的叶螨占据了生态位之后，可能会使得其它种类的叶螨迁入别处。因此，我们推测叶螨种类的这种分布，很可能与所采集田块周边环境中杂草种类和其它作物上发生的叶螨密切关联，或与首先迁入田间的叶螨种类有关，而日本学者还提出田间叶螨种类还可能随着天敌、农事操作等因子进行一定程度的变动(Mori et al.，2008;Gotoh and Mori，2011)。

总之，本研究结果表明截形叶螨和二斑叶螨是北京和河北部分地区蔬菜作物上的优势叶螨种类，而二斑叶螨的耐药性比截形叶螨更强，因此生产实践中防治叶螨首先应该明确其优势种类，在此基础上进行叶螨的针对性防治。

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