PAK4在乳腺结构紊乱中的表达及与钼靶X线的相关性

毕研青+郝敏+田萌子+刘效方+孙文凯+王琳琳

【摘要】 目的：观察PAK4在乳腺结构紊乱组织中的表达，并探讨其与临床影像学在乳腺癌早期诊断中的相关性。方法：对2012年1月-2013年10月在东营市人民医院乳腺科住院手术的150例女性乳腺疾病患者进行了回顾性分析。本院病理科取得患者乳腺标本蜡块，部分患者争取患者同意后行穿刺取乳腺样本。采用HE染色和PAK4免疫组化染色，制作切片在光镜下观察。结果：非增生性病变与乳腺增生伴不典型增生和乳腺癌组进行两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。乳腺增生伴不典型增生与乳腺癌比较差异有统计学意义（P<0.05）。乳腺癌组中PAK4染色的表达与临床影像学钼靶与超声诊断呈正相关性。结论：提示PAK4与乳腺癌演进和转移密切相关，对结构紊乱的乳腺疾病有指导手术治疗的意义。

【关键词】 乳腺结构紊乱； 乳腺癌； 手术指征； 影像学； 分子生物学； PAK4

The Role of PAK4 in the Indications of Breastsurgical Treatment and the Correlation between Its and Molybdenum Target X-ray/BI Yan-qing，HAO Min，TIAN Meng-zi，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：004-007

【Abstract】 0bjective：To investigatethe role of PAK4 in the indications of breast surgical treatment of structural disorder mammary gland and to explore its correlation with clinical imaging in the diagnosis of early breast cancer.Method：150 patients with mammary gland disease who have had surgery treatment were collected from January 2012 to December 2013.The paraffin-embeded samples were obtained from our hospital.HE staining was used to investigate the structure of Mammary gland. PAK4 immunohistochemical staining was used to investigate the expression of different types of breast disease under light microscope.Result：There were obvious difference between the hyperplasia of mammary glands with atypical hyperplasia and the breast cancer about PAK4 immunohistochemical staining.And compared with non proliferative breast disease，the differences were significantly. PAK4 expression in breast cancer group was positively correlation with mammography and ultrasound diagnosis. Conclusion：The PAK4 is closely related to the evolution and transfer of breast cancer and has great significance in the breast surgical treatment in structural disorder of mammary gland disease.

【Key words】 Structural disorder mammary gland； Breast carcinoma； Indications of surgical treatment； Iconography； Molecular biology； PAK4

First-authors address：The Peoples Hospital of Dongying，Dongying 257091，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.002

乳腺结构紊乱是乳腺疾病常见的影像学改变，也是乳腺癌演变过程中的一个阶段，而乳腺癌是危害妇女健康的主要肿瘤。全世界每年约有120万～140万妇女发生乳腺癌，约有50万妇女死于该病。虽然乳腺癌的治疗获得了较快的发展，但我国目前乳腺癌的治疗效果仍较差，相比于美国妇女乳腺癌确诊时80%以上为早期乳腺癌，我国妇女乳腺癌确诊时70%～80%患者已是中晚期，此时手术创伤较大且需要术后行化学治疗，治疗费用较高，对患者的心理及生理影响较大。患者术后的生存期短，生存质量较差。因此，提高我国乳腺癌远期治愈率的关键，取决于对乳腺癌的早期发现、早期诊断、早期治疗。随着影像学的发展，更多的检测手段应用于乳腺病的检查，更多的良性病变被检测到，对评估某些特殊的乳腺影像学结构所致乳腺癌发病的风险性提高了准确性，对指导临床治疗具有重要意义。随着现代分子生物学的发展大家逐渐认识到，真核细胞信号传导过程中，通路蛋白的磷酸化和去磷酸化化学修饰之间的平衡在细胞正常信号转导及肿瘤发生、发展过程中起着非常重要的作用，是信号通路调控的重要方式。对细胞增殖控制不当，未能区分并保持适当的细胞形状和极性可发生癌性转化，这些与控制细胞生长与凋亡的细胞内的信号传导通路的失调密切相关。P21活化蛋白激酶（P21 activated protein kinases，Paks）在此途径中扮演着关键的角色。用免疫组化方法检测P21蛋白表达水平的变化，对于判断乳腺增生到恶变在这一过程中的危险因素及早诊断乳腺癌、为临床指导手术指征等具有重要的理论和实践价值。国内已有通过对P21蛋白在乳腺正常组织及乳腺腺病与乳腺不典型增生组之间，乳腺不典型增生组与增生恶变组之间的检测，对比统计差异相关方面的的研究[1]。

1 材料与方法

1.1 材料 选取本院2012年1月-2013年10月在东营市人民医院乳腺科住院手术的150例女性乳腺疾病患者。全部患者术前均行B超、钼靶检查，提示乳腺结构紊乱，其中，非增生性病变50例，乳腺增生伴不典型增生病[平坦型上皮非典型性增生（FEA）导管上皮内肿瘤1A（DIN 1A）、非典型性导管增生（ADH）导管上皮内肿瘤1B （DIN 1B）]50例、乳腺癌50例，其中非增生病变为A组（年龄18～55岁），乳腺增生伴不典型增生病变为B组（年龄18～56岁），乳腺癌为C组（年龄29～75岁）。本院病理科取得患者乳腺标本蜡块，部分患者争取患者同意后行穿刺取乳腺样本。

1.2 研究方法 将收集的蜡块切片，每个标本切片2份，分别进行HE染色、PAK4免疫组织化学染色。免疫组化染色：（1）脱蜡入水（PBS洗2～3次，每次5 min）。（2）3%H2O2室温孵育30 min（封闭内源性过氧化物酶）。（3）蒸馏水洗3次，5 min/次，浸入PBS 5 min。（4）抗原修复。（5）PBS洗3次，每次5 min。（6）滴加血清封闭液，放置于室温下20 min。（7）倾去血清，不洗，滴加一抗，室温37 ℃孵育l～2 h。（8）PBS洗3次，5 min/次。（9）滴加生物素标记的羊抗兔IgG抗体（二抗），37 ℃孵育10～30 min。（10）PBS洗3次，5 min/次。（11）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min。（12）PBS洗3次，5 min/次。（13）DAB-H2O2显色5～10 min，随时镜检（DAB用时新配）。（14）自来水冲洗10 min。（15）苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，氨水处理。（16）自来水冲洗10～15 min。（17）脱水、透明、封片。光镜下（100倍）对乳腺标本进行结构及免疫组化染色观察。免疫组化染色PAK4染色液及Her2染液由abcam生物技术有限公司提供。

1.3 评价标准 PAK4主要在乳腺腺体细胞的胞浆和/或胞核表达，阳性细胞被染成棕黄色或深棕色，采用一抗来源的同科，动物兔的正常IgG作为阴性对照，以此判断PAK4免疫染色的特异性；与阴性细胞对比鲜明。结果判断参照Campo等的标准，结合具体染色强度和细胞染色百分率进行评分：着色弱为1分，着色中度为2分，着色强为3分，基本不着色为0分；着色细胞占总细胞数5%～25%为1分，26%～50%为2分，等于或大于51%为3分，5%以下为0分。最后以阳性细胞的百分比以及染色强度记分之和所得的总分进行结果判定[10-11]。0分为阴性；1、2分为弱阳性（+）；3、4分为中等阳性（++）；5分或5分以上为强阳性（+++）。抗体阳性标准：PAK4以3、4分（中等阳性，强阳性）以上为阳性，其余0分、1、2分（阴性，弱阳性）为阴性。免疫组织化学检测结果由两位病理学家在相同的判定标准下双盲判定，相同判定结果直接纳入统计，有差异的结果经另一位病理学家双盲判定后取三人判定的平均值纳入统计。钼靶X线阳性判断标准：钼靶提示簇状、泥沙样钙化或者毛刺样、边缘模糊的结节影，BI-RADS分级Ⅳ～Ⅴ级判断为阳性结果。彩超阳性判断标准：肿块形态不规则，边界不清，呈毛刺状或蟹足状，内部回声不均匀，肿块内见微小钙化灶，肿块后方回声衰减、肿块纵横比>1，肿块内血流信号Ⅱ～Ⅲ级，阻力指数（RI）>0.7，提示占位性病变者判断为阳性结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，采用等级资料多个独立样本和两个独立样本非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAK4在三组乳腺疾病中的表达情况 PAK4在非增生性病变（A组）、乳腺增生伴不典型增生（B组）及乳腺癌（C组）中的阳性率分别为6%、40%、78%，三组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 PAK4在三组乳腺疾病中的表达情况

注：A组与B组比较，P<0.05，A组与C组比较，P<0.05，B组与C组比较，P<0.05

2.2 影像学特征及PAK4在50例乳腺癌中的表达情况 50例乳腺癌中PAK4、钼靶、超声阳性表达分别为39例（78%）、39例（78%）、41例（82%）。PAK4表达与钼靶及彩超阳性结果呈正相关性（P>0.05）。见表2，图1～4。

3 讨论

据流行病学研究统计，乳腺不典型增生发展成为乳腺癌的危险性显著增加。乳腺增生是最常见的乳腺疾病，又叫乳腺囊性增生症。包括乳腺疼痛、乳腺小叶增生症、纤维腺病、纤维化增生症、乳腺癌（因为很多乳腺癌是由乳腺增生病恶变产生的）。临床上约有50%妇女有乳腺增生的表现，一般多见于20～50岁的妇女[2]，特别是30岁以上未婚、未育、哺乳少、爱生气的妇女。乳腺增生症与乳腺癌的关系是患者最为关心的问题，也是众多学者争论与研究的焦点。早期及近来众多的研究表明，相对于非增生性乳腺良性疾病而言，乳腺增生不伴非典型增生者有一个小幅增加的乳腺癌发病风险，而乳腺增生伴非典型增生的患者随后发生乳腺癌的发病率明显升高[3-5]。目前普遍采用“非增生性”与“增生性”病变来区分不同的危险性。非增生性病变，并不增加乳腺癌的发病率，而增生性病变发生乳腺癌的相对危险性就升高了，以伴有小叶或导管不典型增生者尤甚。

表2 影像学特征及PAK4在50例乳腺癌中的表达情况 例（%）

图1 乳腺增生病，小叶腺体增生，外围肌上皮细胞阳性，内侧腺上皮细胞阴性（PAK4染色x100）

图2 乳腺纤维腺瘤，纤维组织增生，挤压腺体呈裂隙状，腺体外围肌上皮细胞阳性，内侧腺上皮细胞阴性（PAK4染色X100）

图3 原位癌，瘤细胞散在阳性，但导管外围细胞均阳性（PAK4染色X100）

图4 乳腺浸润性癌，癌细胞胞膜、胞质阳性（PAK4染色×200）

众所周知，影像学的检查方法为目前早期发现、早期诊断乳腺癌的主要途径。乳腺X线钼靶摄影的操作原理是将乳房的三维结构投影为二维图像平面，这种技术以其较好的病变突出性能、低价格、以及其简单实用性使人们将它作为无症状女性对乳腺癌筛查的首选[6]。乳腺癌亦可呈片状、不规则高密度影，但病变区及其周围乳腺结构紊乱，纤维小梁增粗，可有簇状钙化灶，钙化量多，每平方钙化数目在10个以上，局部皮肤增厚、内陷[7]。超声检查无射线损伤，尤其适合妊娠、哺乳期妇女检查及乳腺疾病的普查和随访。其与X线检查相结合被称为目前检查乳腺癌的“黄金组合”。P21活化蛋白激酶（ P21 activated protein kinases， Paks）家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，最早是作为Rho GTP酶Cdc42和Racl的特异性结合物而被发现的[8]，PAK4在第二组PAK中最先被作为Rho GTP酶Cdc42的效应蛋白引起细胞骨架的的改变而被报道者[9]，随后被发现PAK4可被Rho GTP酶单独激活[10]，且其在细胞增殖、分化及转化[11-13]、延长正常细胞寿命及促细胞的凋亡[14]、参与肿瘤细胞的转移[15-17]和正向调节一些正常生理代谢等方面都起重要作用。PAK4能在多种癌细胞与肿瘤中呈高表达[18-20]，一些研究表明Pak4高转化于纤维母细胞，同时也在上皮细胞转化过程中起关键作用。目前，被广泛研究的上皮细胞癌症转化的典型就是乳腺癌，大量的研究显示该蛋白家族中的PAK4在乳腺癌组织中高表达，且远高于在其他肿瘤中，且PAK4表达与乳腺癌和卵巢癌细胞的增殖和侵袭转移呈正相关[21-23]。

本研究发现，乳腺非增生性病变、乳腺增生伴不典型增生、乳腺癌中的PAK4表达总体阳性率依次升高，采用等级资料多个独立样本和两个独立样本非参数检验发现，乳腺增生伴不典型增生与乳腺癌中PAK4表达（图1～4）差异有统计学意义，前两者分别与乳腺非增生性病变相比，差异有统计学意义。笔者对50例乳腺癌患者术前的彩超及钼靶诊断与PAK4染色情况进行了相关性研究发现，PAK4染色与钼靶及彩超在早期诊断乳腺癌中呈正相关性。说明PAK4染色对于判断乳腺增生性疾病到恶变在这一过程中的危险因素及早诊断乳腺癌、为临床指导手术指征等具有重要的理论和实践价值。笔者将进一步对乳腺良性疾病向乳腺癌发展过程中PAK4的变化进行系统的研究，以期将乳腺增生性疾病到恶变PAK4的测量做为手术指征的一重要指标。

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（收稿日期：2014-07-15） （本文编辑：陈丹云）