轮叶蒲桃组织培养试验

吕秀立，练发良，张庆费，商侃侃，戴海英，王军峰，赵彩芳

（1.上海市园林科学研究所，上海 200232；2.浙江省丽水市林业科学研究院，浙江 丽水 323000；3.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

轮叶蒲桃（Syzygium grijsii）系桃金娘科蒲桃属常绿灌木，树体矮小，冠形规则紧凑，叶片细小有光泽，花朵粉白色，雄蕊众多，花丝纤细优美。嫩叶彩叶期较短，约6 ～ 8 d，但由于轮叶蒲桃有多次抽梢的习性，自早春起至有冻害发生前，新梢几乎不间断的抽发，为此其嫩叶彩色效果也可持续很长的时间，具有很好的观赏效果，是传统常用的盆景制作材料。轮叶蒲桃病虫害少，适应性强，自然分布于长江中下游以南的湖北、湖南、江西、浙江、安徽、福建、广东、广西、贵州等地的干燥贫瘠山地中，习性喜阳亦耐阴，耐干旱瘠薄，是难得的集优良观赏性和环境适应性于一体的优良木本地被植物资源。

轮叶蒲桃目前绝大多数种苗为籽播苗，因此个体间性状分离严重，形态差异显著，例如嫩叶叶色有深红色、橙红色、淡红色、嫩绿色等；叶形有长椭圆形、椭圆形、卵形、菱形；叶片的大小有米叶、细叶、小叶；不同个体间抗寒能力也不同，这为实生选种建立优良无性系提供了良好契机。

轮叶蒲桃枝条纤细，积累营养成分少，我们在不同季节，多次进行扦插试验，成活率均不高，且受季节限制，结果不稳定，多代扦插引起了种苗性状退化，因此尝试采用组织培养的方式进行无性繁育，为优良单株的繁育进而形成品系奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

春季取带节茎段为试验材料，节中包含腋芽。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配方设计 初代培养基选择为WPM＋BA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。

增殖阶段，分别采用MS、1/2MS、WPM为基础培养基，NAA0.1 mg/L，BA设置为0.2、0.4、0.8 mg/L 3种浓度梯度。

生根阶段，采用1/2WPM、WPM为基础培养基，NAA、IBA分别设置为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 mg/L 5种浓度梯度。

1.2.2 培养条件 无菌苗于光照条件下培养，光照度1 500 lx，光周期12 h/d，温度25℃。各种培养基的pH调为5.75，蔗糖3%，琼脂0.64%，分装后在高压灭菌锅中121℃条件下保持18 min。

1.2.3 数据统计 统计数据时，每种处理调查20个，统计诱导率、芽增殖系数及生根率。

1.2.4 试管苗的移栽 将生根试管苗洗净培养基后，移栽于草炭与珍珠岩的混合介质中，移栽初期注意保湿。

2 结果与分析

2.1 无菌材料的获得

带节茎段去枝叶后剪成2 cm长的外植体，用自来水洗净，然后于超净工作台上，用75%的乙醇浸泡30 s，10%的“84消毒液”浸泡12 min，无菌水冲洗5 ～ 6次后，接种于初代培养基中，无菌苗获得率为25%。

2.2 芽的分化和增殖

在所设计的培养基中，接种后第15 d可观察到，接种在MS培养基上的试管苗生长不良，发红萎蔫，培养30 d后，逐渐衰弱，直至死亡；1/2MS为基础培养基的几种处理中，组培苗生长黄弱，纤细；而在WPM基础培养基处理中，轮叶蒲桃组培苗叶片绿色，生长良好，增殖迅速。由此可见大量元素的种类及含量会影响轮叶蒲桃组培苗的生长状态。

增殖一般以2 ～ 3个小芽为一单位，粗壮的大芽可切成带两个节位的茎段，插植于增殖培养基上诱导不定芽的分化，切割时注意切除枯死老叶和基部愈伤组织以及剔除不正常芽。随着细胞分裂素浓度的提高，诱导率及增殖系数都随之升高，但当BA浓度达到 0.8 mg/L时，二者均出现下降趋势（表1）。

综合考虑，以培养基WPM＋BA 0.4 mg/L＋NAA 0.1 mg/L做为轮叶蒲桃比较适宜的增殖培养基，每世代增殖系数为2.38左右。

表1 不同激素及不同激素水平对轮叶蒲桃芽增殖的影响Table1 Effect of different hormones and concentrations on bud induction of S.grijsii

2.3 生根培养

生根培养时，发现添加生长素 NAA的培养基容易引起组培苗基部愈伤化，生根率也比较低，而添加IBA的培养基容易诱导生根，且没有愈伤组织生成，培养15 d左右幼苗基部分化出许多白色的根原基，30 d后可以长至4 ～ 6 cm，须根众多，枝叶均能正常生长，形成完整的试管苗。切割不定芽进行诱根培养时，基部要注意切除干净，切口平整，保留芽的高度2 cm。在培养基1/2WPM＋IBA 0.2 mg/L中轮叶蒲桃生根率达到75%，可以做为合适的生根培养基（表2）。

表2 不同激素及不同激素水平对轮叶蒲桃生根的影响Table2 Effect of different hormones and concentrations on rooting of S.grijsii

2.4 试管苗移栽

待轮叶蒲桃根系长至1.5 cm左右长度时，选择根系发达生长健壮的无菌苗从瓶中取出，用自来水洗净根部的培养基，清洗时注意保护根不被折断，并且要彻底洗净根上的琼脂，以免腐烂而影响成活率。用500倍托布津水溶液浸泡根部30 s，然后移栽到草炭：珍珠岩 = 1：1的基质中。移栽初期一周内，需要保持相对湿度95%左右，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照。在温室中驯化45 d后，即可移栽室外，给予肥水管理，轮叶蒲桃在9、10月试管苗移栽其成活率可达80%以上。

3 讨论

迄今，关于蒲桃物种的研究仅限于引种[1～3]、栽培[4]、适应性研究[5]、开花物候特性研究[6]、光合生理研究[7]、叶表皮特征比较[8]等方面。刘小芬等曾对轮叶蒲桃叶片挥发油化学成分进行了细致的分析[9]，我们也对轮叶蒲桃进行了夏季移栽成活率试验[10]，发现采用带土球种植的方式，苗木存储时间在33 h之内，轮叶蒲桃夏季移栽成活率可达97%以上，绿化效果良好。但该属植物单株选优以及离体快繁未见任何报道，本试验首先在国内建立了轮叶蒲桃的组织培养技术体系，为繁育优株建立无性系奠定了基础。

离体植物的生长和形态建成可以通过控制矿质营养的最佳浓度组成来有效调节，植物种和变种对不同矿质营养元素的特异性不同，为优化培养条件，有必要为每一个种甚至基因型确定最佳的营养组成，矿质元素对组培苗生理状态的影响，已有诸多报道[11～14]。在轮叶蒲桃的离体培养中也发现，低盐浓度的WPM基本培养基比较适合其生长，而高盐浓度的MS基本培养基，容易引起它的死亡，说明MS基本培养基里的K、Ca、Mg等离子浓度含量超过了轮叶蒲桃的需要量极限，形成胁迫，不适宜做轮叶蒲桃培养的基础培养基。

植物离体培养研究中，试管苗移栽成活是关键所在，标志着试验的成熟完善，轮叶蒲桃为木本植物，移栽有一定的难度。从本研究的结果看，只要解决好试管苗的根系质量问题，初期保湿，温室炼苗45 d后，再进行室外移栽定植，在9－10月移栽其成活率可达80%以上。

本研究的最终目的是稳定轮叶蒲桃优良性状，并且能够应用于产业化生产，从本研究的结果看，在生产过程中，添加低浓度细胞分裂素和生长素，并采用直接器官发生形式，以芽繁芽进行组培快繁生产出来的试管苗经大田种植，能稳定母株的优良性状，无变异发生，很好地解决了通过种子或扦插繁殖种苗引起的株性分离而制约生产的问题。

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