人类激肽释放酶基因6在卵巢恶性肿瘤中的表达及其机制研究

成志强，王 洋，王晓玫，曾照成，贺黎升，许 静，金红涛

（深圳市人民医院 病理科，广东 深圳518020）

人类组织激肽释放酶基因（kallikrein gene，KLK）家族是由位于19号染色体q13.4区域的300 kb基因序列组成，包含15个人类组织 KLK[1－3]。研究显示：KLK家族中部分基因与人类多种疾病的发生、发展，尤其是在多种恶性肿瘤中密切相关[4－7]。作为妇科常见的恶性肿瘤，卵巢癌的发病率位列女性生殖道恶性肿瘤第三位，其发病率在我国约为女性生殖道恶性肿瘤的22.9%[8]。本研究通过RTPCR的方法检测KLK6的mRNA表达；用免疫组织化学方法检测KLK6蛋白在卵巢肿瘤中的表达情况，初步探讨其KLK6在卵巢癌发生，发展的作用机制，为进一步研究提供理论依据。

1 材料方法

1.1 临床资料 收集自2008年2月至2012年1月，于深圳市人民医院妇产科手术切除的新鲜卵巢癌组织标本30例，交界性肿瘤10例，良性卵巢肿瘤12例（浆液性囊腺瘤8例＋浆液性囊腺瘤4例），以及同期因子宫肌瘤手术切除的正常卵巢组织（经病理证实）新鲜标本15例。将上述组织中部分放入液氮冻存用于RNA提取；部分用福尔马林固定用于免疫组化检测。同时收集深圳市人民医院病理科2008年2月至2012年1月期间的手术存档蜡块65例，其中乳头状囊腺瘤占18例（浆液性10例，黏液性8例），交界性卵巢肿瘤占15例（浆液性9例，黏液性6例），卵巢癌32例。所有卵巢癌组织标本的患者年龄约在22－73岁，≤50岁42例，＞50岁20例；浆液性癌38例，黏液性癌12例，其他12例，按FIGO分期：Ⅰ－Ⅱ期19例，Ⅲ－Ⅳ期43例。组织学分级[9]：G1级11例，G2级27例，G3级24例；淋巴结无转移19例，淋巴结有转移43例。卵巢癌患者均为初发，术前未接受任何过放、化疗及免疫治疗。所有标本均再次做HE染色，由高年资病理医师复核。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 取新鲜标本组织约2g，先用Trizol RNA提取试剂盒（Invitrogen公司）提取总RNA，再以分光光度仪测定RNA的浓度，加以校正统一，后放置于－80℃备用。RT－PCR试剂盒购自TaKaRa公司（大连宝生物），严格参照试剂盒说明书上的实验步骤进行操作。KLK6引物序列上游：5’－ATT TCC CTG ACA CCA TCC AG－3’；下游：5’－GGG ATG TTA CCC CAT GAC AC－3’。内参使用β－actin，上游：5’－CAG CCA TGT ACG TTG CTA TCC AGG－3’；下游：5’－AGG TCC AGA CGC AGG ATG GCA TG－3’。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火25sec，72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min。将增产物置于20g／L琼脂糖凝胶进行电泳。通过KLK6与β－actin条带灰度值的比值来反映KLK6mRNA相对表达量。

1.2.2 免疫组织化学 将新鲜的标本置于石蜡进行包埋切片（厚4μm）。采用免疫组化SP法检测，严格参照试剂盒说明书进行操作。一抗工作浓度为1∶100，用PBS作为阴性对照，用已知KLK6蛋白阳性表达的胃癌组织切片为阳性对照。参考以往的文献[10]制订判读的标准：以棕色颗粒出现在胞质的细胞作为KLK6阳性细胞。根据细胞染色的强度进行计分：细胞无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；还要在高倍镜下随机选取5个视野，每个视野内计数100个细胞，计算阳性细胞占总细胞数的百分比，阳性细胞百分比为0%计0分，＜10%计1分，10%－50%计2分，51%－80%计3分，＞80%计4分。认定两项评分之和≥4分为阳性表达。

1.2.3 统计学处理 采用SPSS17.0进行统计分析，正常卵巢组织与卵巢癌组织中KLK6的mRNA表达水平的比较采用t检验（经正态性检验和方差齐性检验）的方法，卵巢癌中KLK6蛋白的表达与临床病理特征关系的比较采用χ2检验，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 不同卵巢组织中KLK6mRNA的表达（图1）

KLK6在卵巢癌、交界性肿瘤、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织均有不同程度的表达，但在卵巢癌及交界性肿瘤中，KLK6的mRNA表达水平明显高于正常卵巢组织，具有显著差异 （P＜0.01）。

图1 KLK6mRNA在卵巢癌中的表达差异

2.2 不同卵巢组织中KLK6蛋白的表达（图2）

在正常卵巢组织中KLK6蛋白的阳性表达率为13.3%（2／15），在乳头状囊腺瘤组织中KLK6蛋白的阳性表达率为16.7%（5／30），在交界性卵巢肿瘤组织中KLK6蛋白的阳性表达率为44.0%（11／25），在卵巢癌组织中KLK6蛋白的阳性表达率为69.4%（43／62），差异有统计学意义（χ2＝25.843，P＜0.001）。

2.3 卵巢癌患者的KLK6蛋白表达与临床病理特征的关系（表1）

表1 KLK6蛋白表达与临床病理特征的关系

图2 不同卵巢组织KLK6蛋白的表达情况（SP法，×400）

3 讨论

人类组织KLK基因家族是编码丝氨酸蛋白酶的一组同源基因家族，串联排列在19q13.4染色体上，包括 KLKl、KLK2、KLK3（前列腺特异抗原PSA）3种“经典KLK”和新近发现的12种KLK基因（KLK4－KLKl5）。KLKs编码的蛋白酶（hKs）可能参与血管张力与通透性的维持、各种生长因子的裂解激活、调节神经系统可塑性以及皮肤表皮细胞脱落与再生等众多生理过程[11]。

KLK6基因是新近发现的KLK家族成员，编码hK6蛋囟，同时由3个研究小组独立克隆并被以不同名字命名：Anisowicz等[12]从乳腺癌细胞株中克隆出 KLK6cDNA命名为蛋白酶 M（ProteaseM），发现KLK6mRNA在某些乳腺癌细胞株和卵巢癌组织及细胞株中高表达；Yamashiro等[13]从大肠癌细胞株COLO201cDNA文库中克隆出相同基因，命名为neurosin，其在脑组织中高表达；Little等[14]从 Alzheimer＇s病人脑组织中克隆出该基因，命名为zyme，认为KLK6在Alzheimer＇s病的发生发展中有重要作用。

Magklara等[15]研究认为KLKs编码的hK6蛋白在体外可降解细胞外基质的主要成分纤维蛋白原和I型胶原以及基底膜的主要成分IV型胶原。但hK6诱导的ECM降解和肿瘤细胞生物学行为的关系及通过基因敲除等手段探讨KLK6和肿瘤细胞侵袭转移关系尚无研究报道。受类固醇激素的调控是KLKs的一个重要特点，研究证实雄激素上调KLK2和KLK3基因，而KLK6基因则对雌激素更敏感[16]。

综上所述，本文对卵巢肿瘤中KLK6的表达进行检测，结果显示，在卵巢癌、交界性肿瘤组织中KLK6的mRNA水平和蛋白水平明显高于良性肿瘤和正常卵巢组织，这一结果提示KLK6基因在卵巢恶性及低度恶性肿瘤的发生、发展中起到了重要的作用。结合该基因在细胞中的定位，我们认为：KLK6可能是通过调控其下游靶基因的启动或进行转录后修饰调节来参与恶性肿瘤的发生，发展的过程。本研究同样发现临床分期越晚、组织分化越差同时伴有淋巴结转移的卵巢恶性肿瘤组织中KLK6蛋白阳性表达率就越高，提示KLK6可能参与了卵巢恶性肿瘤的侵袭和转移。这也使其有可能成为卵巢恶性肿瘤预后不良的检测指标，为卵巢恶性肿瘤的复发和远处转移的机制研究提供了新思路。

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