测定鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）参考品有效期的经典热加速稳定试验

李 翠，郭彩云，戴志红，蒋 卉，张秀英，温 芳，陆连寿，王在时

（中国兽医药品监察所，北京100081）

鸡传染性法氏囊病（Infectious of bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（Infectious of bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度传染性疾病［1］，是家禽传染性疾病中危害最严重的疫病之一［2］。在我国对该病的主要防治措施是对鸡群进行疫苗免疫［3］，鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）一直作为国内生产使用最为广泛的鸡传染性法氏囊病疫苗。为控制该疫苗的质量，本文研制了参考疫苗作为实物标尺使生产范畴内的疫苗效力值标准化。

标准物质的稳定性是指标准物质的特性量值在规定的时间间隔和环境条件下保持在规定范围内的性质，是衡量标准物质特性量值随时间变化的指标，特性量值不发生明显变化的时间间隔越长，表明该标准物质的稳定性越好。由于标准物质的各项特性值要求均比较高，其制备过程也较为复杂，所以较长的保存期对于标准物质来说非常重要。通常在较低的保存温度下生物制品的失活速度很慢，加之生物制品活性出现的细微下降不易被非常准确地测定，因此在较低温度下往往很难在短时间内计算其有效期。而生物制品在较高温度下的失活速度很快，所以热加速稳定性试验最常被用来在短时间内比较准确地预测生物制品标准物质的有效期［4-5］。本研究首次采用热加速稳定性试验和鸡胚半数致死量（ELD50）测定法测定制备参考疫苗的病毒含量，预期其贮存有效期，以期为今后此类研究提供参考。

1 材料

1.1 鸡传染性法氏囊活疫苗（B87株）参考品 鸡传染性法氏囊活疫苗（B87株），加入5%蔗糖脱脂牛奶（冻干保护剂），同时加入双抗（终浓度1‰），混匀后定量分装至安瓿（1 mL／支），迅速冷冻干燥，并采用充氮融封。由中国兽医药品监察所制备（批号 201111）。

1.2 SPF鸡胚 10～11日龄鸡胚均购自梅里亚维通实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 试验方案 采用经典恒温热加速稳定性试验［6-7］，从几个较高温度下样品的效价失活情况计算其在较低温度下的贮存有效期［8］。同一批次的参考疫苗随机抽取4组样品，每组40支，分别置于56℃、37℃、25℃、4℃保存，其中4℃保存样品在4、8、12、18、24、32、44 周时取样，其他温度保存的样品分别于第0、3天、第1周、2周、3周、4周、6周、8周和之后每半月一次取样，每次取样3支，测定样品ELD50值。每组样品以分装冻干后的ELD50值为基准值，当ELD50值下降2个滴度时停止该组实验。

2.2 不同温度下的衰减速率常数K的计算 大部分蛋白质或生物制品的活性失活基本上都符合一级反应动力学。将时间t与相对效力值的对数lgC进行直线回归，求得各温度下的直线方程，符合方程lgC＝ -K／2.303t+lgC0，可确定该参考疫苗随温度、时间变化符合一级降解反应。根据直线方程的斜率可求得各试验温度下的反应速度常数K值［9-10］。

2.3 -30℃下衰减速率常数K的计算 不同温度的衰减速率常数K与温度的动力学关系符合Arrhenius方程［11］K ＝ Ae-E／RT，即 lgK ＝ lgA+ （-E／RT） ，式中：T为绝对温度，R为摩尔常数，E为活化能，A为指前因子。对某一具体反应常数K为速率常数，是化学反应的一个特征数值，与浓度无关。将56℃、37℃、25℃、4℃下衰减速率常数K按Arrhenius方程拟合出线性回归方程，据此求出-30℃下的K值［12］。

2.4 -30℃下贮存有效期的计算 根据-30℃下的衰减速率常数K及方程lgC＝-K／2.303t+lgC0，即可计算出样品效力值由初始效力值降低到目标效力值所需的时间，即为该样品的贮存有效期。

2.5 长期稳定性监测 随机抽取-30℃下保存1年的参考疫苗3支，测定其ELD50值，以后每隔1年监测一次。

3 结果

3.1 不同温度下的热加速试验结果 参考疫苗在不同温度和不同时间条件下病毒含量的测定结果见表1，结果表明，参考疫苗的保存温度越高，效价下降的速率越快。

表1 不同温度和不同时间下热加速稳定性试验结果

3.2 不同温度下的衰减速率常数K 将不同温度下的热加速稳定性数据按公式lgC＝-K／2.303t+lgC0计算不同温度下的衰减速率常数K，结果见表2。

表2 不同温度下的衰减速率常数K

3.3 -30℃下衰减速率常数K的计算 将不同温度下衰减速率常数K按公式Arrhenius方程拟合出线性回归方程为 lg（-K） ＝-3364.6／T+10.545。据此求出-30℃下的K值为-0.0188。

3.4 -30℃下贮存有效期的计算 根据-30℃下的衰减速率常数 K值及公式 lgC＝-K／2.303t+lgC0，计算出参考疫苗效力值下降1个滴度所需的时间为2.4年。

3.5 长期稳定性监测 -30℃下保存1年的3支参考疫苗lgELD50值分别为4.33、4.21和4.19，未发生明显下降，与热加速稳定性试验预期结果一致。

4 讨论

国外有文献报道，热加速稳定性试验是预测生物制品标准物质稳定性最常用的方法。该方法是根据几个较高温度下样品效价快速失活的速率以Arrhenius方程预测其在较低温度下的贮存有效期［8］。根据Arrhenius方程拟合线性回归必须至少需要3个温度点的要求，而且要根据制品在几个温度点的失活数据拟合线性回归得到比较准确的K值，所以需要科学选择试验的温度点，若温度点间隔较小，则K值随温度变化不明显，若温度太高以致失活太快，则该温度下失活的有效数据太少，都会导致拟合线性回归不理想［8］。在本研究中，设定了56℃、37℃、25℃、4℃为温度点，56℃温度太高，该温度下失活的有效数据太少，另外3个温度点的试验数据按Arrhenius方程拟合出线性回归方程，说明温度点的选择是合适的。

国内也有研究以老化试验预测生物制品稳定性，即根据37℃条件下样品效价失活速率预测其在较低温度下的贮存有效期，该方法只设1个温度点，而热加速稳定性试验至少需要3个温度点，再根据Arrhenius方程拟合线性回归计算样品在较低温度下的贮存有效期，理论上热加速稳定性试验更科学、有效。

热加速稳定性试验所选择的测定方法需要有足够的灵敏度、精密度和重复性，而且要保证每个温度下的测定次数不少于3次，所以测定时需选择适当的时间间隔，可在热加速初期密集测定，再根据下降趋势调整测定频率［13］。本试验采用鸡胚半数致死量测定法计算样品ELD50值，并按先密后疏的策略选择适当的时间间隔，这样既能检测到效价的细微下降，又能检测到大的下降趋势，也保证了总的检测次数。结果表明，拟合线性回归的相关系数较好，说明测定方法和时间间隔的选择也是合理的。

由于生物制品本身的复杂性，加之温度点的选择、每个温度点的测定次数和每次测定的样品数量有限，用热加速稳定性试验预测制品的贮存有效期必然存在一定局限性，仍不能完全替代长期稳定性研究。因此，在标准物质使用过程中，可以热加速稳定性试验预测样品的贮存有效期为依据，按需要进行实际贮存温度下的长期稳定性监测，以确保标准物质实际使用中的有效性。

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［2］张七斤，王克恭.传染性法氏囊病病毒细胞培养的研究［J］.中国畜禽传染病，1992， （6）： 50-52.

［3］谢俊玲.鸡传染性法氏囊的综合防控措施［J］.养禽与禽病防控，2011，（2）：33-34.

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［8］Kirkwood TBL.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅢ.Principles of design ［J］.Journal of Biological Standardization， 1984， 12：215-224.

［9］Tydeman M S， Kirkhood TBL.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅠ.Principles of maximum likelihood estimators［J］.Journal of Biological Standardization，1984， 12：195-206.

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［13］Kirkwood TBL， Tydeman M S.Design and analysis of accelerated degradation tests for the stability of biological standardsⅡ.A flexiblecomputer program for data analysis［J］.Journal of Biological Standardization，1984， 12：207-214.