兽用“复方草连”纳米注射液的制备及其退热作用初探

李伟泽，赵 宁，韩文霞，周永强

（西安医学院陕西省生物医药重点实验室，西安710021）

猪高热综合症对集约化、规模化的养殖业造成了巨大的经济损失［1-2］。目前，临床上常用激素、解热镇痛与抗生素类药物治疗，这些药物的退热效果好，但能够降低患猪的免疫功能与抗应激能力［3］；另外，不合理使用抗生素也会诱发其他不良反应［4］，抗生素由于不易代谢还可通过食物链对人类社会造成潜在的危害［5］。中草药活性成分为天然获取，在猪只体内易代谢、不残留、不污染生态环境，符合健康养殖的发展趋势［6-7］。传统中药水针剂由于制备工艺的限制只能保留水溶性部位而将疗效显著的挥发油类损失，因而，在一定程度上弱化了中药的疗效。纳米胶束能够增加脂溶性药物在水溶液中的溶解度，且形成的胶束体系是一个澄清透明的热力学和动力学稳定体系［8］，在药剂学领域有着广泛的应用前景。本文首次将挥发油以纳米胶束的形式增溶于中草药的水溶性药液中制备兽用“复方草连”纳米注射液（专利号：201310015265.4），并研究了其相关性质与退热作用，以期为我国养殖业的发展提供一种中草药绿色兽药。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 安乃近注射液，邯郸市格润动物药业有限公司，批号20120705；乙醇、丙三醇、聚山梨酯-80，南京威尔化工有限公司；石油醚，天津化学试剂，分析纯；老鹳草、连翘、防风、柴胡、知母、刺五加，购于西安怡康药店，经鉴定符合《中华人民共和国兽药典》二○一○年版二部。

1.2 仪器 GCMS-QP2010气-质联用色谱仪；Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪；CELL-DYN®1200血细胞分析仪；H-7000透射电镜；JY2002型电子天平；Cogent-M1型半自动超滤系统；微孔滤膜过滤器；挥发油提取装置，自制。

1.3 动物 发热病猪24头（非急性传染性发热），体重70 kg，山西省芮城县某养猪场。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件 J＆W DB-17弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱初温 60 ℃，保温1 min，然后以5℃／min升温速率升至230℃，保温3 min；进样口温度250℃；载气为高纯氦气（＞99.999%）；柱前压 57.4 kPa，柱流量 1 mL／min，分流比 1：30；进样量为 1 μL。

1.4.2 中药材提取 称取处方量老鹳草、连翘、防风、柴胡，混合后加入12倍量的水，浸泡30 min，蒸馏并收集挥发油约7.5 mL，密闭，备用；分离煎煮液和药渣，药渣再煎煮提取2次，每次25 min，将所得药液合并，得到提取液1，备用；

取处方量知母与刺五加，加入10倍量的水，浸泡25 min，煎煮提取40 min，分离提取液和药渣；药渣中再加入8倍量的水提取2次，每次30 min，将3次提取液合并，得到提取液2。

1.4.3 药液精制 提取液1与提取液2合并，减压浓缩至清膏（每毫升相当于生药材2.5 g左右），放至室温，加入乙醇使含醇量到65%，4℃冷藏24 h，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，加5%的明胶液280 mL，搅匀，再加乙醇使含醇量到85%，4℃冷藏24 h，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，并浓缩得到清膏；加注射用水至500 mL，再加入5 mL聚山梨酯-80，搅匀，4℃冷藏24 h，过滤，得水沉液；水沉液经过超滤（截留分子量10000），得超滤液，备用。

1.4.4 “复方草连”纳米注射液制备 将7.5 mL挥发油与45 mL聚山梨酯-80、30 mL丙三醇混匀，再缓慢加入1.5.2中的超滤液，搅匀，加注射用水至600 mL，于4℃冷藏72 h，过滤除掉沉淀，得滤液；滤液经0.22 μm的滤膜过滤2次后灌封（10 mL／支），灭菌，即得。

1.4.5 挥发油胶束的考察 取适量样品液滴于铜载网上，晾干，置于2.0%磷钨酸溶液中染色，用滤纸吸取多余的染色液，晾干，置于透射电镜下观察其外观结构；另取适量样品液注入激光粒度分析仪，测定其粒径和表面Zeta电位。

1.4.6 纳米胶束中挥发油的气相色谱图取新制备的样品50 mL，用石油醚萃取2次，将萃取液合并后按照上述色谱条件测定挥发油的气相色谱图；将适量样品置于温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%的加速试验条件下放置6个月，然后按照上述处理方法处理，测定6个月后的挥发油的气相色谱图。

1.4.7 对患猪的治疗情况

1.4.7.1 对发热状态的影响 将患猪随机分为2组，每组12头。第1组为安乃近注射液组：每头按安乃近5 mL／kg（安乃近含量30%）肌肉注射安乃近注射液；第2组为“复方草连”纳米注射液组：每头按0.5 mL／kg肌肉注射“复方草连”纳米注射液（每毫升相当于原生药材2.87 g）。2组早晚各给药1次，连用3 d后，分别测试肛温并作好记录，并观察临床症状。

1.4.7.2 对外周血液T细胞亚群CD3+和CD4+含量（%）的影响 将2组患猪分别于给药前与给药3 d后，进行前腔静脉无菌采血，血液样品用血细胞分析仪测定T淋巴细胞亚群的CD3+和CD4+含量。

2 结果与分析

2.1 样品的制备 采用超滤技术与聚山梨酯-80两步加入方式所制备的“复方草连”纳米注射液，在40±2℃条件下放置6个月仍然澄清透明。如不采用超滤技术，则在相同条件下放置20 d左右，药液即可出现浑浊与挂壁现象；在制备过程中如将挥发油与聚山梨酯-80混合后直接加入药液，就会产生少许沉淀［9］而影响制剂的澄明度。

2.2 挥发油胶束的考察 本文所制备的挥发油胶束在电镜下观察为大小均匀的圆球型结构，（图1）；其粒径为100±12 nm，（图2），表面 Zeta电位为-83.2±0.8 mV（图3）。一般而言，当纳米颗粒的Zeta电位绝对值高于30 mV时，纳米粒表面就存在大量净电荷，净电荷产生的静电排斥力有利于提高纳米颗粒的稳定性并促使其粒径大小均匀［10］。

图1 挥发油胶束的透射电镜照片

图2 挥发油胶束的粒径分布

图3 挥发油胶束的表面Zeta电位

2.3 纳米胶束中挥发油的稳定性 挥发油易挥发、易氧化，因而挥发油的稳定性对于药效发挥具有重要作用。将“复方草连”纳米注射液置于温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%条件下放置 6 个月，第0个月与第6个月的气相色谱图如图4、5所示。图4、5中主要色谱峰的峰数目、峰形、峰高与位置等基本一致，表明挥发油在加速试验条件下放置6个月基本未发生变化，说明胶束能够增加挥发油的稳定性；胶束是一个透明的热力学和动力学稳定体系［8］，挥发油进入到胶束内核的疏水性液态空间，被聚山梨酯-80形成的分子膜包围，避免了与药液等外部环境的直接接触，从而避免了挥发油的扩散挥发与氧化。

图4 胶束中挥发油在0个月的气相色谱图

图5 胶束中挥发油在6个月的气相色谱图

2.4 “复方草连”纳米注射液对患猪的初步疗效由结果可知，“复方草连”纳米注射液与安乃近用药3 d后均能有效降低患猪的体温，改善患猪的临床症状，二者之间无显著性差异（t-test，P＞0.05），具体见表1，表明“复方草连”纳米注射液具有一定的退热作用，具体的作用机理还需要进一步的深入研究。治疗3 d后，安乃近组患猪的外周血液CD3+CD4+含量（%）由用药前的 24.08±2.44降低至18.33±4.18；而“复方草连”纳米注射液组患猪外周血液CD3+CD4+含量（%）由用药前的23.77±2.66升高至28.59±5.53，且与安乃近组间有显著的差异（ttest， P ＜0.05），具体见表 2，表明“复方草连”纳米注射液具有一定的提高患猪免疫力的作用。

表1 安乃近与“复方草连”纳米注射液对患猪体温的影响

表2 安乃近与“复方草连”纳米注射液对患猪CD3+CD4+含量的影响

3 讨论

3.1 组方方解与分析 “复方草连”注射液由老鹳草、连翘、防风、柴胡、知母、刺五加等配伍而成，其中老鹳草、连翘具有清热解毒的功效而为君药，现代研究表明二者具有广谱抗菌抗病毒作用，均含有挥发油类特别是连翘挥发油的抗菌抗病毒作用优于其水溶性成分［11］；防风和柴胡具有祛风解表、透表泄热的功效而为臣药，均含有挥发油类，可用于感冒发热、寒热往来等，现代研究表明二者具有较好的解热镇痛与抗过敏作用；刺五加与知母共为佐药，刺五加具有益气健脾、补肾安神与祛风除湿的功效，能够增强机体的抗应激能力与免疫力，使机体能够耐受各种有害刺激包括物理、化学与生物应激的有害影响［11］，而知母具有清热泻火、养阴生津的功效，符合中医“清热需养阴”的理论，可用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳与肠燥便秘等；全方具有“清热解毒、疏风解表、益气健脾、养阴生津”的功效，对于猪高热综合症具有标本兼治的作用。

3.2 制备工艺 传统的中药水针剂制备工艺不能有效提取并保留挥发油类，因而，在一定程度上弱化了中药的疗效。本文在制备工艺上采用了双提法提取中药材，同时得到挥发油与水溶性部位，保持了中草药多成分、多靶点、多功效的综合作用特点；采用超滤技术对药液进行处理，有效除掉了水溶性高分子杂质，从而解决了在存储过程中出现浑浊而引起的澄明度问题；挥发油纳米胶束在制备过程中采用聚山梨酯-80分步加入方式，避免了聚山梨酯-80与药液中某些杂质成分形成沉淀而影响制剂澄明度的弊端［9］；挥发油进入到纳米胶束的内核而极大地增加了其在水溶液中的溶解度，且被聚山梨酯-80形成的分子膜包围，避免了扩散挥发与氧化从而提高了稳定性。

3.3 药理功效的探讨与展望 长时间与大剂量应用激素、解热镇痛与抗生素能够抑制患猪免疫功能、降低抗应激能力［12］，在一定程度上促进了病毒、细菌在体内的变异与复制而不利于疾病的治疗，而抗生素残留也限制了我国畜禽产品的出口贸易。本文初步研究结果表明“复方草连”纳米注射液具有一定的退热作用与提高患猪的外周血液T细胞亚群CD3+、CD4+含量即免疫力的作用，而免疫力的提高还可以进一步增强患猪的抗应激能力；这对于疾病具有“标本兼治”的作用，但具体的作用机理与规律还需要进一步的深入研究与探讨。另外，“复方草连”纳米注射液为中草药制剂，其活性成分为天然获取，具有易代谢、不蓄积与不污染生态环境的独特优势，符合健康养殖的发展趋势［12］，能够有效地避免临床上应用激素、解热镇痛与抗生素类药物的弊端与危害，具有广阔的应用前景。

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