非离子表面活性剂对泰乐菌素效价和A组分含量的影响

谢文静，张 萍，石彦鹏

（宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101）

泰乐菌素，又名泰乐星，是一类16元大环内酯类畜禽专用抗生素，它的产生菌有弗氏链霉菌、龟裂链霉菌和吸水链霉菌，其中弗氏链霉菌是泰乐菌素的主要产生菌，也是其工业化生产菌株。泰乐菌素主要由泰乐菌素A、脱碳霉糖泰乐菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四种组分构成，其中泰乐菌素A为主要组分，且生物活性最高。细胞膜不仅是高度选择性的屏障［1］，把细胞质与外界环境分隔开，使细胞获得一个相对稳定的内环境，而且它在细胞与环境之间的物质交换、能量转换和信号传导等过程中也起着重要作用［2］。在泰乐菌素的发酵过程中，细胞膜的通透性是影响菌体对氧及营养物质利用的重要因素，对泰乐菌素产能及产量的提高有很大的影响。非离子表面活性剂可以增加细胞膜的通透性［3］，减少氧及营养物质进入细胞的传递阻力，还可以使胞内的目标产物释放到胞外，可减少由于产物积累而造成的产物反馈抑制［4］。因此本文在摇瓶条件下研究了非离子表面活性剂对泰乐菌素细胞生长和泰乐菌素效价及A组分转化的影响，以确定泰乐菌素发酵过程中最佳非离子表面活性剂Tween-20的添加时间和添加量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 紫外可见分光光度计（T6新世纪），北京普析通用仪器有限责任公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30KBS），上海申安医疗器械厂；高效液相色谱仪（LC20AG），日本岛津公司。

1.1.2 主要试剂 PEG 600，化学纯，Tween-20、L-Met，分析纯，均购自天津大茂化学试剂厂；乙腈、甲醇，色谱纯，美国Fisher科技公司。

1.1.3 供试菌株 泰乐菌素产生菌TLG13-48，由本公司提供。

1.1.4 培养基 种子培养基：豆饼粉、玉米浆为本地农副产品，酵母膏购自北京奥博星试剂公司，碳酸钙购自甘肃天玉化工厂。装量30 mL／250 mL，三角瓶。

发酵培养基：棉籽饼粉购自甘肃禾麟，玉米蛋白粉、玉米粉为当地农副产品，碳酸钙购自甘肃天玉化工厂，盐酸甜菜碱、磷酸氢二氨、氯化钠、氯化钾都为分析纯试剂。装量35 mL／250 mL，三角瓶。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 菌株活化：制备数支斜面，室温放置2 d，使斜面表面干燥。取斜面保藏的供试菌株一支，用玻璃棒蘸取孢子，均匀的涂布到已制备好的斜面上，29℃培养8 d，供后续实验所用。种子制备：取新鲜斜面一支，用接种铲接种于种子培养基中，在28℃，200 r／min的条件下培养46 h。发酵培养：将培养好的种子液接种于发酵摇瓶中，28 ℃，200 r／min 培养160 h。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 泰乐菌素标准曲线绘制［5］精密称取适量的泰乐菌素标准品，用纯化水稀释制得1000 U／mL的溶液，分别用纯化水稀释成 700、600、500、400、300 U／mL的标准液，各吸取1 mL加入25 mL的容量瓶，用 0.1 mol／L盐酸定容，摇匀后静置。以0.1 mol／L盐酸做空白对照试验，用分光光度计在290 nm处测量吸光值，以该标准液的浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制标准曲线（图1）。

图1 泰乐菌素标准曲线

泰乐菌素浓度在吸光值为0.3～0.7的范围内线性相关，对数据进行线性回归，得到方程：y＝41.715x+0.3159 （R2＝ 0.9949） 。

1.2.2.2 泰乐菌素效价测定［6］取发酵液5 mL，加入20%硫酸铝溶液1.5 mL，搅拌，过滤，根据估计效价稀释至可检测范围，吸取稀释过的溶液1 mL至25 mL容量瓶中，加0.1 mol／L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，以0.1 mol／L的盐酸溶液做空白对照，用分光光度计在290 nm处测量吸光值，查标准曲线相对应的数据乘以稀释倍数即可。

1.2.2.3 泰乐菌素组分测定［7］HPLC色谱条件：色谱柱 C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相0.85 mol／L高氯酸钠溶液-乙腈（18 ∶13）；检测波长 290 nm；流速 1 mL／min；进样量 10 μL。 用HPLC测定、计算萃取分离过程中溶剂相与水相中的各组分纯度与含量。

2 结果

2.1 不同浓度的PEG 600对泰乐菌素效价和组分A的影响

2.1.1 摇瓶发酵0 h时添加不同浓度的PEG 600对泰乐菌素效价和组分A的影响 以不添加表面活性剂为对照，不同浓度的PEG 600对泰乐菌素效价及组分的影响结果见表1。

表1 摇瓶发酵0 h添加不同浓度的PEG 600后泰乐菌素的效价和组分

由表1可知，摇瓶发酵0 h时添加3.0%的PEG 600，效价提高幅度最大，比对照提高了11.7%。添加浓度为3.5%的PEG 600，其效价与对照基本一致，但组分A提高幅度最大，比对照提高了9.0%。

2.1.2 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度的PEG 600对泰乐菌素效价和组分A的影响 发酵摇瓶培养至50 h时，添加不同浓度的PEG 600 2 mL，终浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%，以不添加表面活性剂为对照，对泰乐菌素效价及组分的影响结果见表2。

表2 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度的PEG 600后泰乐菌素的效价和组分

由表2可知，发酵培养50 h时添加不同浓度的PEG 600，效价均有提高，添加浓度为4.0%的PEG 600，效价提高幅度最大，比对照提高了20.8%。组分A的含量比对照均降低，添加浓度为4.0%的PEG 600，组分A下降幅度最大，比对照降低了27%。

2.2 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度的L-Met对泰乐菌素效价和组分A的影响 发酵摇瓶培养至50 h时，添加不同浓度的L-Met 2 mL，终浓度分别为0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%，以不添加表面活性剂L-Met为对照，对泰乐菌素效价及组分的影响结果见表3。

表3 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度L-Met后泰乐菌素的效价及组分

由表3可知，发酵培养50 h时添加不同浓度的L-Met，随着L-Met浓度的增大，效价降低，组分A增高。只有0.01%的L-Met能够提高效价，比对照提高了2.3%，但组分A比对照降低了6.5%。

2.3 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度的Tween-20对泰乐菌素效价和组分A的影响 发酵摇瓶培养至50 h时，添加不同浓度的Tween-20 2 mL，终浓度分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，以不添加表面活性剂Tween-20为对照，对泰乐菌素效价及组分的影响结果见表4。

表4 摇瓶发酵50 h时添加不同浓度的Tween-20后泰乐菌的效价和组分

由表4可知，发酵培养50 h时添加不同浓度的Tween-20，效价均比对照有所提高，其中添加浓度为3.5%时，效价提高幅度最大，比对照提高了53.5%，但组分A的含量比对照均降低，添加浓度为3.5%时，组分A下降最大，比对照下降了42.7%。

3 讨论与小结

非离子表面活性剂可以改变气-液、液-液及液-固界面性质，使其具有起泡、消泡、乳化、分散、渗透、助溶等多方面的性能，因此非离子表面活性剂广泛应用于人类活动的各个领域，从化妆品调和、食品与饲料加工、皮革制品加工、化学纤维加工、纺织品印染及整理、医药的加工、矿物浮选、石油开采、油品处理、工业洗涤等各个工业部门，被誉为“最高效的工业味精”。

本实验在泰乐菌素发酵中添加非离子型的表面活性剂 PEG 600、Tween-20、L-Met，结果表明 PEG 600、Tween-20两种非离子表面活性剂均能促进泰乐菌素效价的提高，但对泰乐菌素组分A的转化有抑制作用；L-Met对泰乐菌素产效价能力有抑制作用，但对泰乐菌素A的转化有促进作用，可以促进大菌素C向泰乐菌素A的转化。因此，在泰乐菌素发酵中添加非离子型表面活性剂主要可以对菌体细胞膜的通透性进行调控，以利于营养物质的进入或代谢产物的释放，从而达到提高产量的目的。

［1］张星元.发酵原理［M］.北京：科学出版社，2005：416-417.

［2］刘永康，陈国民.细胞膜对大分子物质及颗粒物质的跨膜转运［J］.现代医药卫生.2006，22（5）：674-675.

［3］袁丽红，周名立，欧阳平凯.表面活性剂Tween20对紫草细胞生产紫草素的影响［J］.南京化工学院学报，1994，16（3） ： 16-19.

［4］Guo W J， Cande las L G， Kolattukudy PE1.Cloning of a novel constitutively expressed pectatelyase gene pelB from Fusar iumsolanif1 sp1 p is i（Nectria haema tococca， mating type V I）and characterization of the gene product expressed in Pichiapastoris［J］.J Bacteriol，1995， 177（24）： 7070-70771.

［5］石彦鹏，张 丽，张 萍.硫酸亚铁对泰乐菌素发酵的影响［J］.中国兽药杂志，2009，43（6）：30-31.

［6］戚 薇，王建玲，韩英素，等.发酵液中泰乐菌素测定方法的研究［J］.天津轻工业学院学报，1999，14（1）：1-4.

［7］Klug-Santnera B G， Schnitzhofera W， Vrs anskM， et al.Purificationand characterization of a new b ioscouring pectatelyase from Bacillus pumilus BK［J］.J Biotechno1， 2006， 121：390-401.