猪瘟活疫苗（传代细胞源）免疫猪的攻毒保护试验

张毓金，林旭埜，吴文福，任向阳，游启有，岑小清，张木辉，冯忠武，冯忠泽，宁宜宝

（1.广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 511356；2.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081）

猪瘟是猪的一种高度接触性病毒性传染病,对我国养猪业造成的损失很大，我国将其列为一类动物传染病。目前，疫苗免疫接种仍是预防控制猪瘟的最有效的手段。我国在1954年成功培育了猪瘟兔化弱毒株，由此制备的猪瘟兔化弱毒组织苗在我国的猪瘟防控工作中发挥了重要的作用[1-2]。但由于组织苗有着生产工艺不稳定、病毒滴度不高、成本较高等诸多问题，近年来我国研制出采用传代细胞系生产的猪瘟活疫苗，不仅生产工艺稳定，还能够有效解决疫苗中BVDV外源病毒污染的问题，保证了疫苗的质量[3]。

近年来，我国成功研制的猪瘟活疫苗（传代细胞源）在实验室取得大量可靠数据，在此研究基础上，本试验将其在猪场进行临床应用试验，通过对田间免疫猪进行猪瘟强毒攻击，并采用阻断ELISA方法对试验血清样本进行猪瘟抗体检测，以评估该疫苗在猪场实际使用的免疫保护效果。

1 材料

1.1 试验用疫苗 猪瘟活疫苗（传代细胞源）5批，均由广东永顺生物制药股份有限公司生产，经检验全部合格。批号分别为ST0801、ST0802、ST0803、ST0804、ST0805，病毒含量8500RID/头份。

1.2 试验猪 来源于广东韶关某猪场（简称韶关场）、广东广州某猪场（简称广州场）两个种、肉猪配套场。

1.3 攻毒用强毒 猪瘟石门系血毒，由广东永顺生物制药股份有限公司制备、鉴定、保存。

1.4 猪瘟抗体ELISA检测试剂盒 购自IDEXX公司。

1.5 猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒 购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

2 方法

2.1 分组 取ST0801、ST0802两批疫苗，每批疫苗在广州场各免疫仔猪500头，分别标记为A、B组；取ST0803、ST0804、ST0805三批疫苗，每批疫苗在韶关场各免疫仔猪400头左右，分别标记为C、D、E组；从每场随机选取条件相同的仔猪各10头不免疫疫苗，作为非免疫对照猪，运回广东永顺生物制药股份有限公司健康猪舍饲养。

2.2 免疫程序与方法 采用20日龄首免，60日龄进行二免，每头猪耳后颈部肌肉注射猪瘟活疫苗（传代细胞源）1头份，免疫仔猪在原猪场按正常方法饲养。

2.3 免疫猪的免疫监测 首免前对供试仔猪抽血并分离血清，用ELISA方法检测猪瘟抗体（CSFAb）；二免后28 d(攻毒前)、90 d(攻毒前)分别抽血并分离血清，用ELISA方法检测相应时期的猪瘟抗体（CSF-Ab）。

2.4 强毒攻击 从两个猪场分别于二免后28 d、90 d各抽取不同批次疫苗免疫的猪5头，同时选取相同猪场相同日龄的非免疫对照猪各5头，在广东永顺生物制药股份有限公司负压控制动物舍进行强毒攻击，每头猪注射猪瘟石门系强毒血毒1.0mL（105.0MLD）。

2.5 免疫效果评价 攻毒后每天观察临床症状，每天上、下午各测体温1次，连续观察16 d，将攻毒死亡猪抽取心血并分离血清，用RT-PCR方法检测猪瘟抗原（CSF-Ag）、用ELISA方法检测猪瘟抗体（CSF-Ab）；对存活猪于攻毒后16 d分别抽血并分离血清，用RT-PCR方法检测猪瘟抗原（CSF-Ag）、用ELISA方法检测猪瘟抗体（CSF-Ab）。

2.6 抗体检测方法

2.6.1 操作方法 按试剂盒的使用说明书进行。

2.6.2 判定标准 猪瘟抗体检测试验（阻断ELI⁃SA）成立条件：阴性对照的平均OD450值应大于0.50，阳性对照的阻断率应大于50%，试验方成立有效。样品阻断率=（阴性对照平均OD450值-样品OD450值）/阴性对照平均OD450值 ×100%。被检样品的阻断率不小于40%，该样品为猪瘟抗体阳性；样品阻断率不大于30%，该样品为阴性；样品阻断率在30%～40%之间，该样品为可疑。

3 结果

3.1 免疫猪的猪瘟血清抗体合格率检测结果 广州场A、B两组20日龄仔猪（免疫前）的猪瘟母源抗体阳性率为70%（7/10），二免后28 d（攻毒前），猪瘟血清抗体合格率为80%（8/10），攻毒后观察16 d（试验结束）的猪瘟血清抗体合格率为90%（9/10）；二免后90 d（攻毒前）的猪瘟血清抗体合格率为90%（9/10），攻毒后观察16 d（试验结束）的猪瘟血清抗体合格率为90%（9/10）。韶关场C、D、E三组20日龄仔猪（免疫前）的母源抗体阳性率为67%（10/15），二免后28 d（攻毒前）的猪瘟血清抗体合格率为87%（13/15），攻毒后观察16 d（试验结束）的猪瘟血清抗体合格率为93%（14/15）；二免后90 d（攻毒前）的猪瘟血清抗体合格率为93%（14/15），攻毒后观察16 d（试验结束）的猪瘟血清抗体合格率为93%（14/15）。结果见表1～2。

3.2 免疫猪的检测结果

3.2.1 用RT-PCR方法检测CSF-Ag结果 试验组免疫猪攻毒前后与非免疫对照猪攻毒前采集血清，用RT-PCR方法检测猪瘟病毒抗原，结果均为阴性，而对照组攻毒死亡猪的血清中CSF-Ag检测结果均为100%阳性。结果见表3。

3.2.2 试验猪临床观察结果 用猪瘟活疫苗（传代细胞源）两次免疫后的第28天和第90天，对试验组与非免疫对照猪同时进行强毒攻击保护试验，攻毒后每天测猪体温2次，同时观察临床症状，连续观察16 d。结果表明，免疫猪体温、食欲均正常，精神状况良好，所有猪健活，而非免疫对照猪全部发病死亡。结果见表1～2。

如表1、表3所示，在猪场临床应用条件下，按20日龄首免，60日龄二免的程序进行免疫，每头猪接种猪瘟活疫苗（传代细胞源）1头份，广州场二免后28 d的血清猪瘟抗体合格率为80%，韶关场二免后28 d的血清猪瘟抗体合格率为87%，二免后28 d免疫猪体内检测不到猪瘟病毒抗原；免后28 d后，免疫猪能有效抵抗猪瘟强毒攻击，免疫猪既无体温升高，也无猪瘟临床症状，全部健活，攻毒16 d所有猪体内均检测不到猪瘟病毒抗原，而两个猪场的非免疫对照组100%（10/10）死亡，10头对照猪血清中猪瘟病毒抗原检测均为阳性。

表1 猪瘟活疫苗（传代细胞源）二免后28 d攻毒试验抗体

表2 猪瘟活疫苗（传代细胞源）二免后90 d攻毒试验

表3 血清中猪瘟抗原阳性率检测

如表2、表3所示，在猪场临床应用条件下，按20日龄首免，60日龄二免的程序进行免疫，每头猪接种猪瘟活疫苗（传代细胞源）1头份，广州场二免后90 d的血清猪瘟抗体合格率为90%，韶关场二免后90 d猪瘟血清抗体合格率为93%。二免后90 d免疫猪体内均检测不到猪瘟病毒抗原，用猪瘟强毒攻毒后既无体温升高，也无临床症状，全部健活，攻毒后16 d所有猪体内均检测不到猪瘟病毒抗原，而两个猪场的非免疫对照组100%（10/10）发病死亡，死亡猪血清中猪瘟病毒抗原检测均为阳性。

4 讨论与结论

4.1 猪瘟传代细胞苗免疫效果 猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛应用对我国猪瘟疾病的有效防控有着重要的作用[4]。已有研究表明，应用该疫苗免疫接种的猪，可以抵抗不同猪瘟病毒基因亚群野毒的攻击，提供很好的免疫保护效果[4-5]。采用猪传代细胞系（ST细胞系）生产的猪瘟疫苗与传统方法利用牛睾丸细胞（原代细胞）制备的猪瘟病毒疫苗相比，生产工艺更加稳定，批间差异减小，同时更好的控制BVDV污染问题[1]。试验结果表明，猪瘟活疫苗（传代细胞源）免疫猪均能有效抵抗猪瘟强毒的攻击，既无死亡，也无猪瘟临床症状；免疫猪能产生很好的免疫保护力，猪瘟抗体合格率均为80%以上。

4.2 制定合理的免疫程序 实施有效防疫的重要环节就是制定一个科学合理的免疫程序。合理的免疫程序是有效疫苗产生良好免疫效果的重要条件，其中包括接种次数、首免年龄、接种时间间隔等内容[6-8]。

猪瘟活疫苗（传代细胞源）在实验室条件下免疫接种一次，免疫猪即可获得一年以上的免疫保护（另报），然而，在猪场实际使用会遇到如猪瘟母源抗体干扰、其他病原混合感染等诸多问题，因此在生产实际中建议进行两次免疫。

在实际使用中，考虑到尽量避开高水平母源抗体对猪瘟活疫苗产生免疫效力的干扰作用，经过大量的研究证明，猪瘟母源中和抗体水平在30日龄到35日龄时开始出现下降拐点（另报），因而，我们通常推荐的猪瘟免疫程序是30日龄首免，本试验采用20日龄首免，就是想了解较高的母源抗体对疫苗免疫的影响。

本试验结果证明，在猪场临床应用条件下，按照20日龄首免，60日龄进行二免的方法，猪瘟活疫苗（传代细胞源）能突破较高水平母源抗体的干扰，疫苗能对免疫仔猪提供很好的免疫保护力。

4.3 选择科学的检测方法 测定猪场实际使用情况下猪瘟活疫苗的免疫效力对推广使用猪瘟疫苗具有重要意义。目前，用于猪瘟疫苗免疫效果评估的方法有很多，选择一个科学合理的检测方法是科学评估的首要问题。在农业部制定的《2010年国家动物疫病强制免疫计划》中，将经猪瘟抗体阻断ELISA方法检测阳性抗体判定为合格[9]。ELI⁃SA试验具有快速、敏感、重复性好、样品用量少、结果容易判断等优点，是当前生产实际中最常用的猪瘟免疫效果检测评估方法题[10-11]。

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