自行设计的多重链接探针扩增组合对多发畸形患儿的诊断价值

杨 琳 樊子川 张 萍 吴冰冰 王慧君 周文浩

多发畸形(multiple congenital anomalies，MCA)是指某一个体的一个或多个系统在出生时即发生的一种或多种形态或结构上的异常，新生儿的发病率约为3%［1］。目前已经识别诊断的MCA已达300余种。由于MCA表型存在明显的异质性，仅依靠临床表型达到确诊较为困难。

针对MCA遗传学病因的分子遗传学检测技术不断发展。大量研究表明，精神性疾病、神经性疾病和先天性疾病等存在拷贝数变异(CNV)的异常。多重链接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)是近年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术［2］，属于多重PCR技术，是一种检测目的基因CNV的方法。荷兰MRC-Holland公司应用MLPA技术，对常见的一些MCA的探针分别设置在了不同的试剂盒(P036、P064、P095、P245、P297 等)，在选择上述不同试剂盒时需要对常见MCA的表型有很好认知，但在中国具有分子遗传学背景的临床医生还不多，临床工作中面对MCA亟待针对性强的、涵盖更大范围疾病的和经济的分子水平生物学诊断技术。本研究根据13种常见的MCA的关键区域或关键基因，应用MLPA探针设计流程设计合成新的MLPA探针组合，期望对常见的MCA有较高的阳性诊断率，为临床治疗和遗传咨询提供帮助。

1 方法

1.1 研究设计 检验自行设计的MLPA探针组合诊断MCA的准确性，以微阵列比较基因组杂交(array comparative genomichybridization，aCGH)作为金标准;再以MLPA探针组合行MCA临床诊断效果评估。本文对MCA的定义为临床发现≥2个的畸形表型。

1.2 MCA病例来源 MLPA探针组合与金标准比较的病例:来源于我院新生儿出生缺陷生物样本库，存有提取了DNA的血标本，人口学信息和临床表型;临床诊断效果评估病例:来源于2012年3月至2014年3月我院住院诊断为MCA的病例，取临床检验剩余的EDTA抗凝血提取全基因组DNA，并进行MLPA检测。MLPA探针组合用于MCA临床诊断得到了我院伦理委员会批准。

1.3 临床信息采集 收集MLPA探针组合检测阳性患儿临床资料，采集人口学信息:性别、胎龄、出生体重、母孕年龄、家族史等。临床表型:特殊面容、肌张力、新生儿听力筛查、B超、超声心动图和头颅MRI/CT等影像学表现。

1.4 MLPA探针设计及合成

1.4.1 MCA及其关键基因的选择 参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/GeneTests/Review?db=GeneTests中常见MCA的描述，选择发病率相对较高、病因主要为染色体部分重复/缺失的综合征。并根据该描述及已发表的相关文献报道，选择关键基因或关键区域。若尚未明确关键基因或关键区域，选择重复/缺失片段两端各一及中间位置的3个基因，以代表该区段。

1.4.2 探针序列的设计 选择的目的基因序列在http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat中获得，并区别标记编码区、SNP及重复序列。针对每个目的基因，探针均由左半序列和右半序列组成，左半序列5'端至3'端依次为:左通用引物序列和左半探针序列;右半序列5'端至3'端依次为:磷酸标记、右半探针序列和右通用引物序列。左、右探针序列与目的基因的目的序列相同，并可在连接酶的作用下直接相连。左、右序列满足如下条件:①序列长度唯一性;②GC含量在50%左右;③Tm值≥70℃;④在连接位点不含SNP;⑤无二级结构;⑥在人类基因组内无相同重复序列。序列GC含量、Tm值检测采用Raw Probe软件;二级结构的检测在线(http://mfold.rna.albany.edu)进行;在线(http://genome.uscs.edu/cgi-bin/hgBlat)检测人类基因组内是否为特异性序列。

1.5 MLPA探针组合序列的合成 设计好的序列，送SIGMA公司合成(鉴于MLPA探针序列和实验流程占用较多版面，如有需要可与本文通讯作者联系索取)。

1.6 MLPA探针组合检测及异常判断标准 按照标准操作流程进行MLPA实验，采用Genemarker Demo 1.97版本软件进行数据分析。MLPA数据结果显示相对峰高度比＜0.75或者 ＞1.25认为是异常结果［3］。

2 结果

2.1 MCA及其关键区域或关键基因选择结果 共13种常见的 MCA:21-三体综合征(KCNJ6、DYRK1A、RCAN1 基因)，18-三体综合征(MC2R、DTNA、TCF4 基因)，13-三体综合征(EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 基因)，1p36 区域缺失综合征(GABRD、SKI、TP73基因)，5q35.3区域缺失综合征(Sotos综合征，NSD1基因)，CHARGE综合征(CHD7基因)，7q11.23区域缺失综合征(Williams Beuren综合征，CLIP2、ELN、LIMK1 基因)，22q11.21 区域缺失、重复综合征(DiGeorge综合征，SNAP29、TBX1、ZNF74 基因)，17p11 区域缺失综合征(Smith-Magenis综合征，RAI1、MFAP4基因)，5p15.2区域缺失综合征(Cridu Chat综合征，CTNND2、TERT基因)，15q11-13区域缺失综合征(Prader-Willi综合征，OCA2、UBE3A、GABRB3 基因)，4p16.3 区域缺失综合征(Wolf Hirschhorn 综合征，MSX1、WHSC1、LETM1 基因)，17q21.31区域缺失综合征(MAP3K14、MAPT基因)。

2.2 aCGH和MLPA探针组合检测结果 来自于我院新生儿出生缺陷样本库的35例MCA中，aCGH检测阴性24例，阳性11例(31.4%)，共诊断9种;MLPA探针组合检测阴性29例，阳性6例(17.1%)，共诊断4种;MLPA组合探针检测阳性的6例微缺失和重复与11例aCGH检测阳性一致，6例MLPA探针组合检测阳性的变异位点均位于MLPA探针组合设计中，MLPA探针组合检测阴性的5例变异位点均不在MLPA探针组合设计中。来自于我院住院诊断为MCA的122例患儿中，MLPA探针组合检测阴性101例，阳性21例(17.2%)，诊断6种。

2.2 MCA病例诊断结果 本文以MLPA探针组合共检测157例MCA患儿，做出遗传学病因诊断27例;MLPA探针组合共检出7/13种(53.8%)，分别为21-三体综合征8例，18-三体综合征1例，15q11-q13区域缺失综合征3例，5p15区域缺失综合征3例，22q11区域重复综合征1例和22q11区域缺失综合征9例，7q11.23区域微缺失综合征1例，5q35区域缺失综合征1例。部分 MLPA检测结果见图1A～G。

2.3 MLPA探针组合检测阳性病例一般情况 表1显示27例MLPA探针组合检测阳性患儿的临床信息，男性18例，女性9例。8例21-三体综合征患儿(例1～8)，男性6例、女性2例，胎龄信息缺如，出生体重(2 918±1 051)g，母孕年龄(34.8±5.4)岁;3例 Prader-Willi综合征患儿(例10～12)，男性2例、女性1例，平均胎龄不详，出生体重(2 167±638)g，母孕年龄(27.0±8.2)岁，例11家族史中第一胎有面部畸形、通贯手、脑发育异常和多囊肾表型，并于出院后3d死亡;10例 DiGeorge综合征患儿(例13～22)，男性6例、女性4例，胎龄不详、5例出生体重、母孕年龄不详;3例猫叫综合征患儿(例23～25)，均为男性，胎龄不详，出生体重(2 728±949)g，母孕年龄(32.0±3.6)岁，例23的祖父母为表兄妹近亲结婚，其有一伯父智力低下。

3 讨论

CNVs检测的技术方法较多，如荧光定量PCR、荧光原位杂交技术(FISH)、MLPA和以微阵列平台为基础的全基因组分析技术［4，5］。全基因组微阵列分析技术可以发现约99%的染色体结构畸变，有报道将其推荐为首选的MCA的筛查检测手段，但是其昂贵的检测价格限制了其在临床检验中的应用［6～8］。FISH的价格相对便宜，临床检验效率较高［9］，但是对染色体亚端粒失衡和微缺失的检测还存在一定的局限性。MLPA技术克服了荧光定量PCR检测能力不足的缺点，一次能够分析40～45个序列，并具有更高的分辨率、灵敏度和可重复性。同时，MLPA较微阵列平台的检测方法，更加经济、快捷，针对性更强，更适合作为临床的常规检测方法进行推广应用

表1 27例 MLPA 阳性患儿详细临床信息Tab1 Clinical manifestayions and MLPA positive results of 27 patients

本研究以aCGH为金标准，检测了自行设计MLPA探针组合对MCA诊断和应用价值。35例MCA aCGH共诊断9种，包括MLPA探针组合检测阳性的4种;aCGH共诊断了11例MCA，包括MLPA探针组合诊断的6例MCA;6例MLPA探针组合检测阳性的变异位点均位于MLPA探针组合设计中，而5例检测阴性的变异位点均不在MLPA探针组合设计中。检验自行设计的MLPA探针组合诊断的准确性，最好是能取得更多的MCA样本，并且包括设计的全部病种，本文作为与aCGH金标准检验的MCA病例仅为35例，也仅所包括设计的4个病种，虽然MLPA探针组合检出的微缺失和重复与aCGH金标准相同，但仍有较大的缺憾。35例MCA检测阳性率17.1%，122例我院住院诊断为MCA中，MLPA探针组合检测阳性17.2%，说明MLPA探针组合在与金标准比较的样本和临床诊断效果评估的样本中都取得一致的诊断率，而且随着样本量的增加，又多检出了3种，仍然没有完全包括涵盖的全部MCA，MLPA探针组合尚有6种MCA没有被检出，与本文检测的MCA病例数少有关。有些检验阳性患儿的非典型临床发现可能与临床表型异质性相关，也可能与临床表型发现不完整有关。与荷兰MRC-Holland公司的商业化试剂盒相比，本研究涉及的13种MCA虽然与其有部分重叠，但是本MLPA探针组合整合了13种常见的病因主要为染色体部分重复/缺失的综合征的探针，相比起来更加简便，更适合没有深刻遗传学背景的临床医生对MCA的遗传咨询和诊断需要。

临床实践中，有多种MCA的首要临床表现相似，而且有些患儿的临床表现不典型，很难及早做出临床诊断，通过分子检测技术可以对这些临床表现相似的综合征进行鉴别诊断。例如，Prader-Willi综合征患儿，其新生儿期典型的临床表现为肌张力低下和喂养困难，特异性较差，与一些其他综合征有相似的临床表现，临床上较难进行鉴别诊断，表1中例11主要临床表现为新生儿期肌张力低下、隐睾、小阴囊，表1中例10和12临床表现不典型，仅通过临床表型，很难做出临床诊断，对患儿的预后影响很大。DiGeorge综合征是22q11微缺失综合征中最常见的一种，属于原发性细胞免疫缺陷病，其临床表现主要为先天性心脏病、腭发育不良、低血钙、免疫缺陷和特殊面容［10］。患儿通常合并有免疫缺陷，对先天性心脏病的患儿进行筛查可以早期明确诊断，给予患儿相应的治疗，提高患儿的生存质量。表1中例13仅表现为耳前赘生物、喉璞、左肾肾盂轻度增宽，这些表型都可以在22q11缺失综合征中出现［11，12］，但仅凭这些非典型的临床表现很难做出临床诊断。此外本研究还检出1例22q11微重复综合征，本病通过常规的染色体G显带技术很难发现22q11区域的微重复，大多数22q11微重复综合征都是通过MLPA探针检出的［13］。

综上，本研究通过自行设计的MLPA探针组合，对临床发现为MCA的患儿进行了遗传学病因诊断，取得了较高的诊断率，在分子水平上对一些常见的MCA和临床表现不典型的或者有相似临床表型的患儿明确了遗传学病因，相比其他的检测手段，MLPA技术快速、准确和简便，在临床检验方面有一定的应用价值，对患儿的临床治疗、预后和家庭遗传咨询有一定的指导作用。

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