归肾丸对DOR小鼠卵巢超微结构的影响*

2014-11-21 07:59崔丹丹马雯雯宋坤琨丁嘉慧张明敏
中西医结合研究 2014年3期
关键词:脂滴超微结构颗粒细胞

崔丹丹 马雯雯 文 露 宋坤琨 丁嘉慧 黄 聪 张明敏

华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所,武汉 430030

近年来,随着生活压力的增加,女性绝经年龄提前,卵巢功能低下现象日趋严重。卵巢储备功能,又称卵巢储备(ovarian reserve),是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、并形成可受精的卵母细胞的能力,能反映女性的生育潜能和生殖内分泌功能。若卵巢内存留的可募集卵泡数目减少及卵子质量下降则称为卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve,DOR),常伴有经量减少,月经稀发甚至闭经、不孕等,严重影响患者的身心健康,乃至家庭的稳定,所以积极防治十分必要。DOR的发病率国内尚未见报道,但有日益增多的趋势。DOR进一步可发展为卵巢早衰,而卵巢早衰病因不明[1-3],治疗颇为棘手,尚无有效治疗措施,因此如何减缓卵巢功能衰退的速度以恢复卵巢功能,进而提高生活质量,是目前生殖内分泌研究的一项重要课题。

传统中医典籍尚无DOR相对应病名,根据其临床表现,可归属“月经后期或过少”、“闭经”、“血枯”、“血隔”、“断经前后诸证”、“不孕”等范畴,目前尚缺乏系统、全面的理论阐述和证治方法。但从补肾调冲着手辨证论治,显示了中医药疗效的优势。本研究用C57BL/6J小鼠通过连续超促排卵及臭氧接触建立生理性卵巢衰老模型,也即是DOR模型,探讨归肾丸对DOR小鼠的颗粒细胞超微结构的影响,为临床运用中药治疗卵巢功能衰退提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级5周龄C57BL/6J雌性小鼠,由武汉大学实验动物中心提供。所有小鼠均饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心屏障系统。严格保证饲养环境为12h光照,12h暗室,温度为18~22℃,相对湿度为70%~85%。雌雄分笼饲养,自由饮水和进食(标准饮食)。

1.2 主要试剂与仪器

归肾丸为配方颗粒组方,颗粒制剂由三九医药制品有限公司提供,组方为:熟地浓缩颗粒6.0g(等于熟地20g),山茱萸浓缩颗粒1.7g(等于山茱萸10 g),山药浓缩颗粒1.5g(等于山药10g),菟丝子浓缩颗粒0.5g(等于菟丝子10g),枸杞浓缩颗粒4.0g(等于枸杞10g),杜仲浓缩颗粒0.5g(等于杜仲10 g),当归浓缩颗粒3.0g(等于当归10g),茯苓浓缩颗粒1.0g(等于茯苓10g)组成。人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)购自丽珠医药集团股份有限公司,孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)和前列腺素 F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)购自杭州动物药品厂。苏木精-伊红试剂购自湖北百奥斯生物科技有限公司,FEI-Tecnai G212型透射电子显微镜购自荷兰FEI电子光学有限公司。

1.3 模型建立及分组

小鼠适应性饲养7d左右,其后进行阴道涂片,观察动情周期,将连续2个动情周期正常的小鼠纳入实验,共16只小鼠随机分为正常组、模型组、归肾丸组和脱氢表雄酮(DHEA)组。参照 Miyamoto等[4]的方法,除正常组外的其他三组予以腹腔注射5IU PMSG,54h后给予5IU HCG腹腔注射,19h后再行25IU PGF2α腹腔注射。3次注射为1个周期,12h后开始下1个周期,共进行10个周期。同时,实验期间每天21∶00~次日9∶00将小鼠放入臭氧接触箱中,保持臭氧接触箱中臭氧浓度稳定在2.8mg/m3。而正常组则接受生理盐水腹腔注射,常规饲养。第10次连续超排HCG腹腔注射完成后次日上午,正常组及模型组给予生理盐水0.3ml灌胃,归肾丸组与DHEA组则给予相应药物灌胃,药物剂量按照小鼠与人体表面积转换系数计算后,每只小鼠每天灌胃0.3 ml。第21天灌胃结束后于动情后期颈椎脱臼处死,均从背腹侧剖腹,迅速取出双侧卵巢,共得32个卵巢,其中16个卵巢放入2.5%戊二醛电镜固定液,其余卵巢放入4%多聚甲醛固定。

1.4 苏木精-伊红染色观察卵巢形态

卵巢固定包埋后,沿纵轴行连续切片,厚度为4μm,每2~3片贴于一张载玻片,采用苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察卵巢形态。

1.5 电镜超微结构观察

卵巢组织块用2.5%戊二醛与1%锇酸双固定,丙酮逐级脱水,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染色,于电子显微镜下观察。

2 结果

2.1 各组卵巢苏木精-伊红染色

正常组小鼠卵巢内可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡、初级卵泡位于浅层,数目较多,体积小,呈圆形或椭圆形;生长卵泡大小不一,成熟卵泡多位于浅表部,可见卵泡腔、卵细胞及卵丘结构;颗粒细胞呈多层,形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞呈梭形排列。模型组小鼠卵巢皮质变薄,初级卵泡含量降低,多数卵泡呈囊性扩张,扩张的卵泡壁颗粒层细胞层次明显减少,黄体计数较少;归肾丸组与DHEA组中则可见卵巢皮质间质细胞增生,同时可见皮质内出现许多初级卵泡、生长卵泡及少量成熟卵泡,颗粒细胞层数增加,黄体组织数量增多。见图1。

2.2 卵巢透射电镜结果

正常组的卵泡颗粒细胞,可见线粒体形态规则,管型明显,数量丰富,且脂滴较多;模型组中线粒体肿胀明显,还出现了空泡化改变,且较少看到脂滴,胞质浓缩;归肾丸组与DHEA组电镜下均可见颗粒细胞内线粒体丰富,管型为管状脊,胞质内含有大量脂滴。见图2。

图1 各组小鼠卵巢组织光镜图(苏木精-伊红染色,×400)

图2 各组小鼠卵巢超微结构改变

3 讨论

近年来,由于生活工作压力的增加,环境的影响,以及不孕症人口高龄化,卵巢储备功能降低的患者逐渐增多,改善卵巢储备功能降低患者的情况,提高妊娠率,是当今生殖医学和生殖健康研究的一个热点和难点。卵巢功能低下是卵巢早衰的前奏,应给予高度的重视和积极的治疗。本实验采用序贯连续超排卵10次以及臭氧吸入来造模,旨在观察归肾丸对卵巢功能衰退小鼠超微结构的影响。

造模根据是基于自由基理论,由活性氧等引起的细胞内氧化损伤是造成衰老的重要因素[5-6],而连续超排卵能降低始基卵泡池的假说。新生儿的卵巢中约含有200万个始基卵泡,而到绝经时,卵巢中还剩下大约1 000个卵泡[7-8]。妇女在绝经前,不间断地卵泡发育(卵泡发育不同时期)展示了一种选择性的生理性细胞死亡过程:大多数卵泡最终闭锁消失,仅有不到1%的卵泡发育成熟、排卵。虽然卵泡闭锁基本机制目前还不完全清楚,但越来越多的研究[9-10]表明,颗粒细胞凋亡触发了卵泡闭锁。本实验研究结果显示,正常组光镜下可见到卵巢皮质内有较多的各级生长卵泡、成熟卵泡及黄体,而模型组生长卵泡较少,且电镜观察到其卵巢颗粒细胞内线粒体较少,还出现了空泡化改变,且较少看到脂滴。而归肾丸组与DHEA组,光镜检测结果显示,均可见各级生长卵泡及成熟卵泡、黄体数目均较多。电镜下可见其线粒体丰富,管型明显,胞质内有大量脂滴。胆固醇是合成性激素的重要原料,当细胞内含大量的胆固醇时则以脂滴形式存在[11]。有报道[12]称,高电子密度脂滴在较年轻颗粒细胞中比较常见,但在年纪较大的颗粒细胞中基本不出现,这与本文的结果一致。因此推断连续超排联合臭氧吸入可能通过影响细胞内脂肪代谢,进而导致甾体激素合成的下降,造成卵巢功能低下,而归肾丸明显能够改善其卵巢超微结构,是否能够导致甾体激素合成的增加,尚需进一步深入的研究。

近年来,DOR病例在临床上比较常见,对其产生的病理机制仍不十分清楚,治疗多以激素为主。许多研究[13-15]显示,DHEA 可以改善卵巢储备功能,提高妊娠率,降低流产率,也有报道[16]称,DHEA能提高卵巢反应不良患者的雄激素水平,有效改善其卵巢储备功能和促排卵效果,进而提高IVF-ET的妊娠率。故本实验使用DHEA作为对照治疗组。DOR在中医学范畴属于月经不调、经断前后诸证、不孕等。由于肾在中医理论中对于女性生殖生理非常重要,如《素问·上古天真论》云:“女子七岁,肾气盛,齿更发长;二七而天癸至,任脉通,太冲脉盛,月事以时下,故有子……七七任脉虚,太冲脉衰少,天癸竭,地道不通,故形坏而无子也”。故认为肾虚乃DOR的主要病理基础。本实验选用具有补肾作用的归肾丸,研究其对DOR模型小鼠卵巢超微结构的影响,以期给临床治疗提供强有力的依据。

本实验结果提示,归肾丸能改善DOR模型小鼠颗粒细胞线粒体肿胀、空泡化以及脂滴的情况,而颗粒细胞线粒体的改变是否会导致颗粒细胞的凋亡,脂滴的减少是否会导致甾体类激素的下降,尚需要进一步的研究。

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