埃博霉素产生菌的纯化及其意义

任闪闪+刘延霆+杨联合+赵博宇+牛春玲

随着比紫杉醇临床效果更佳的埃博霉素被发现，埃博霉素的产生菌——纤维堆囊菌日益引起重视，本文通过对其纯化方法进行探索，简化纯化步骤，缩短纯化周期，为埃博霉素的进一步研究奠定基础。

埃博霉素 纤维堆囊菌 分离纯化

目前最为知名的抗肿瘤药物非紫杉醇莫属。但由于紫杉醇提取于红豆杉，而红豆杉又数量有限，后续资源不足，因此寻找与紫杉醇的代替者就显得尤为重要。埃博霉素（Epothilones）与紫杉醇的作用机制相同，埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抗性。埃博霉素来源于粘细菌的纤维堆囊菌属。但由于粘细菌不能以单细胞的形态进行生长且生长缓慢，因此分离纯化困难，纯化周期长，因此进一步探索粘细菌尤其是纤维堆囊菌的快速分离纯化显得尤为重要。

1材料与方法

1.1土样

采集河南中医学院的土样及腐殖质。

1.2主要试剂和仪器设备

常规试剂自上海生工；提取DNA相关试剂，PCR相关试剂均购自于北京天根生物公司。主要仪器设备：体式显微镜stekeo discovery V8；倒置显微镜DP73 TH4-200等。

1.3分离、纯化所需的培养基

CNST培养基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土样采集的标准及初步处理

将采集的有机质含量丰富（富含其它微生物）的土壤样品，自然风干后研成粉末状，平铺在灭过菌的平皿中，用配成适当浓度的制霉菌素液（1片/50mL无菌水）过夜处理，干燥后二次处理，将二次处理后干燥的土样装入灭过菌的离心管中待用。

1.4.2纤维堆囊菌分离富集纯化及验纯

纤维堆囊菌的分离富集一般用CNST培养基。配制CNST灭菌后待其冷却至不烫手时，加入30～40U经过过滤除菌的放线菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的庆大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨苄青霉素，凝固后，贴上1.5～2cm见方的灭菌滤纸片，每皿4张，倒置平板，在超净台中放置1-2天后除去培养基水汽。

将土样研碎后，适量匀撒在滤纸片上，每个CNST平板接一个土样。先在30℃的培养箱中培养一周，之后将接有土样的平板置于室温下继续培养，在解剖镜下坚持每天观察，如果滤纸片变橘红或者橙红色或者有菌膜出现则用接种铲将变色部分（此为纤维堆囊菌的子实体部分）或菌膜转接至新的平板上。对于纤维堆囊菌的纯化，主要是在显微镜下转接其子实体或菌膜，具体方法为：先将在显微镜下观察到的较纯的菌膜或子实体的位置在平皿底部标出，之后在超净台中用注射器转接至新的加有各种抗生素的CNST平板上，多次转接后（此时霉菌的量大大减少），对菌体（主要是子实体）进行洗涤。

对于染菌严重的子实体，用过滤好的放线菌酮配成溶液，具体浓度是0.05mg/mL，分装至各个1.5mL的离心管中，然后在离心管中接入染菌子实体，于56～57℃水浴3～4h（个别染菌严重的子实体可以提高水浴温度，但不能超过57℃），之后将子实体转接至新的平板，待菌重新长出。如果仍有染菌，可以多次重复此步骤。直至可以长出完整透明的菌膜。

1.4.3纤维堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并适当稀释作为模板，进行PCR扩增菌株16S rDNA序列。所用引物为细菌常用引物：27f和1492r。PCR 扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保温。

2实验结果

2.1纤维堆囊菌的分离纯化——形态观察

可以观察到子实体在滤纸上大量堆积，培养基中3～5成团，20～200μm，呈黄色、橙红色、棕黄色、铁锈色、黑色；营养细胞呈圆柱状，末端钝圆，长2.5～10μm；粘孢子在形态上与营养细胞区别小，长1～3μm；其扩展菌膜辐射状或扇状，边缘通常有树枝状或其它不规则突起。如图1，符合纤维堆囊菌形态学上的特征。

A B

C

图1 不同生长周期的纤维堆囊菌（5×）

A在滤纸上刚刚完成富集；B扩展到滤纸边缘的营养细胞；C营养细胞在琼脂上完成富集，形成大量子实体

2.2纤维堆囊菌的分离纯化-分子生物学鉴定

纯化的纤维堆囊菌16S rDNA序列与NCBI上的基因序列相比较，相似性都在98%以上。

3讨论

结合纤维堆囊菌特殊的生长特点：（1）菌体细胞可聚集形成肉眼可见的子实体结构；（2）在贫瘠的培养基上易形成扩展的菌落；（3）粘细菌的子实体或粘孢子具有较高的耐热性。本文创新性地使用了抗生素洗涤法与高温处理法相结合，大大提高了纯化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性较差，而将二甲亚砜作为溶剂加入培养基中又严重影响纤维堆囊菌的生长且有刺激性气味。故有必要找出能够替代制霉菌素的抗生素，最终发现用水溶性较好且相对浓度较高的放线菌酮对子实体进行洗涤，可以达到同样的抑制霉菌的效果。结合纤维堆囊菌的子实体耐高温这一相对优势生理特点对其进行高温水浴，在抑制甚至杀死其它杂菌的同时又不影响纤维堆囊菌的生长。

通过此方法，使纤维堆囊菌的纯化时间由之前的半年甚至一年缩短至一到两个月。相对于微生物的传统纯化方法和粘细菌的其他纯化方法，本文的试验方法简单高效，为纤维堆囊菌资源提供更加丰富和多样的研究材料，同时也为大量获得埃博霉素（Epothilones）及其结构类似物提供更多的原始产生菌。

参考文献：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint

随着比紫杉醇临床效果更佳的埃博霉素被发现，埃博霉素的产生菌——纤维堆囊菌日益引起重视，本文通过对其纯化方法进行探索，简化纯化步骤，缩短纯化周期，为埃博霉素的进一步研究奠定基础。

埃博霉素 纤维堆囊菌 分离纯化

目前最为知名的抗肿瘤药物非紫杉醇莫属。但由于紫杉醇提取于红豆杉，而红豆杉又数量有限，后续资源不足，因此寻找与紫杉醇的代替者就显得尤为重要。埃博霉素（Epothilones）与紫杉醇的作用机制相同，埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抗性。埃博霉素来源于粘细菌的纤维堆囊菌属。但由于粘细菌不能以单细胞的形态进行生长且生长缓慢，因此分离纯化困难，纯化周期长，因此进一步探索粘细菌尤其是纤维堆囊菌的快速分离纯化显得尤为重要。

1材料与方法

1.1土样

采集河南中医学院的土样及腐殖质。

1.2主要试剂和仪器设备

常规试剂自上海生工；提取DNA相关试剂，PCR相关试剂均购自于北京天根生物公司。主要仪器设备：体式显微镜stekeo discovery V8；倒置显微镜DP73 TH4-200等。

1.3分离、纯化所需的培养基

CNST培养基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土样采集的标准及初步处理

将采集的有机质含量丰富（富含其它微生物）的土壤样品，自然风干后研成粉末状，平铺在灭过菌的平皿中，用配成适当浓度的制霉菌素液（1片/50mL无菌水）过夜处理，干燥后二次处理，将二次处理后干燥的土样装入灭过菌的离心管中待用。

1.4.2纤维堆囊菌分离富集纯化及验纯

纤维堆囊菌的分离富集一般用CNST培养基。配制CNST灭菌后待其冷却至不烫手时，加入30～40U经过过滤除菌的放线菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的庆大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨苄青霉素，凝固后，贴上1.5～2cm见方的灭菌滤纸片，每皿4张，倒置平板，在超净台中放置1-2天后除去培养基水汽。

将土样研碎后，适量匀撒在滤纸片上，每个CNST平板接一个土样。先在30℃的培养箱中培养一周，之后将接有土样的平板置于室温下继续培养，在解剖镜下坚持每天观察，如果滤纸片变橘红或者橙红色或者有菌膜出现则用接种铲将变色部分（此为纤维堆囊菌的子实体部分）或菌膜转接至新的平板上。对于纤维堆囊菌的纯化，主要是在显微镜下转接其子实体或菌膜，具体方法为：先将在显微镜下观察到的较纯的菌膜或子实体的位置在平皿底部标出，之后在超净台中用注射器转接至新的加有各种抗生素的CNST平板上，多次转接后（此时霉菌的量大大减少），对菌体（主要是子实体）进行洗涤。

对于染菌严重的子实体，用过滤好的放线菌酮配成溶液，具体浓度是0.05mg/mL，分装至各个1.5mL的离心管中，然后在离心管中接入染菌子实体，于56～57℃水浴3～4h（个别染菌严重的子实体可以提高水浴温度，但不能超过57℃），之后将子实体转接至新的平板，待菌重新长出。如果仍有染菌，可以多次重复此步骤。直至可以长出完整透明的菌膜。

1.4.3纤维堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并适当稀释作为模板，进行PCR扩增菌株16S rDNA序列。所用引物为细菌常用引物：27f和1492r。PCR 扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保温。

2实验结果

2.1纤维堆囊菌的分离纯化——形态观察

可以观察到子实体在滤纸上大量堆积，培养基中3～5成团，20～200μm，呈黄色、橙红色、棕黄色、铁锈色、黑色；营养细胞呈圆柱状，末端钝圆，长2.5～10μm；粘孢子在形态上与营养细胞区别小，长1～3μm；其扩展菌膜辐射状或扇状，边缘通常有树枝状或其它不规则突起。如图1，符合纤维堆囊菌形态学上的特征。

A B

C

图1 不同生长周期的纤维堆囊菌（5×）

A在滤纸上刚刚完成富集；B扩展到滤纸边缘的营养细胞；C营养细胞在琼脂上完成富集，形成大量子实体

2.2纤维堆囊菌的分离纯化-分子生物学鉴定

纯化的纤维堆囊菌16S rDNA序列与NCBI上的基因序列相比较，相似性都在98%以上。

3讨论

结合纤维堆囊菌特殊的生长特点：（1）菌体细胞可聚集形成肉眼可见的子实体结构；（2）在贫瘠的培养基上易形成扩展的菌落；（3）粘细菌的子实体或粘孢子具有较高的耐热性。本文创新性地使用了抗生素洗涤法与高温处理法相结合，大大提高了纯化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性较差，而将二甲亚砜作为溶剂加入培养基中又严重影响纤维堆囊菌的生长且有刺激性气味。故有必要找出能够替代制霉菌素的抗生素，最终发现用水溶性较好且相对浓度较高的放线菌酮对子实体进行洗涤，可以达到同样的抑制霉菌的效果。结合纤维堆囊菌的子实体耐高温这一相对优势生理特点对其进行高温水浴，在抑制甚至杀死其它杂菌的同时又不影响纤维堆囊菌的生长。

通过此方法，使纤维堆囊菌的纯化时间由之前的半年甚至一年缩短至一到两个月。相对于微生物的传统纯化方法和粘细菌的其他纯化方法，本文的试验方法简单高效，为纤维堆囊菌资源提供更加丰富和多样的研究材料，同时也为大量获得埃博霉素（Epothilones）及其结构类似物提供更多的原始产生菌。

参考文献：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint

随着比紫杉醇临床效果更佳的埃博霉素被发现，埃博霉素的产生菌——纤维堆囊菌日益引起重视，本文通过对其纯化方法进行探索，简化纯化步骤，缩短纯化周期，为埃博霉素的进一步研究奠定基础。

埃博霉素 纤维堆囊菌 分离纯化

目前最为知名的抗肿瘤药物非紫杉醇莫属。但由于紫杉醇提取于红豆杉，而红豆杉又数量有限，后续资源不足，因此寻找与紫杉醇的代替者就显得尤为重要。埃博霉素（Epothilones）与紫杉醇的作用机制相同，埃博霉素A、B和D对癌细胞的生物活性与紫杉醇相当，甚至更强，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇强10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，结构更简单，对紫杉醇抗性的肿瘤细胞也有抗性。埃博霉素来源于粘细菌的纤维堆囊菌属。但由于粘细菌不能以单细胞的形态进行生长且生长缓慢，因此分离纯化困难，纯化周期长，因此进一步探索粘细菌尤其是纤维堆囊菌的快速分离纯化显得尤为重要。

1材料与方法

1.1土样

采集河南中医学院的土样及腐殖质。

1.2主要试剂和仪器设备

常规试剂自上海生工；提取DNA相关试剂，PCR相关试剂均购自于北京天根生物公司。主要仪器设备：体式显微镜stekeo discovery V8；倒置显微镜DP73 TH4-200等。

1.3分离、纯化所需的培养基

CNST培养基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土样采集的标准及初步处理

将采集的有机质含量丰富（富含其它微生物）的土壤样品，自然风干后研成粉末状，平铺在灭过菌的平皿中，用配成适当浓度的制霉菌素液（1片/50mL无菌水）过夜处理，干燥后二次处理，将二次处理后干燥的土样装入灭过菌的离心管中待用。

1.4.2纤维堆囊菌分离富集纯化及验纯

纤维堆囊菌的分离富集一般用CNST培养基。配制CNST灭菌后待其冷却至不烫手时，加入30～40U经过过滤除菌的放线菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的庆大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨苄青霉素，凝固后，贴上1.5～2cm见方的灭菌滤纸片，每皿4张，倒置平板，在超净台中放置1-2天后除去培养基水汽。

将土样研碎后，适量匀撒在滤纸片上，每个CNST平板接一个土样。先在30℃的培养箱中培养一周，之后将接有土样的平板置于室温下继续培养，在解剖镜下坚持每天观察，如果滤纸片变橘红或者橙红色或者有菌膜出现则用接种铲将变色部分（此为纤维堆囊菌的子实体部分）或菌膜转接至新的平板上。对于纤维堆囊菌的纯化，主要是在显微镜下转接其子实体或菌膜，具体方法为：先将在显微镜下观察到的较纯的菌膜或子实体的位置在平皿底部标出，之后在超净台中用注射器转接至新的加有各种抗生素的CNST平板上，多次转接后（此时霉菌的量大大减少），对菌体（主要是子实体）进行洗涤。

对于染菌严重的子实体，用过滤好的放线菌酮配成溶液，具体浓度是0.05mg/mL，分装至各个1.5mL的离心管中，然后在离心管中接入染菌子实体，于56～57℃水浴3～4h（个别染菌严重的子实体可以提高水浴温度，但不能超过57℃），之后将子实体转接至新的平板，待菌重新长出。如果仍有染菌，可以多次重复此步骤。直至可以长出完整透明的菌膜。

1.4.3纤维堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并适当稀释作为模板，进行PCR扩增菌株16S rDNA序列。所用引物为细菌常用引物：27f和1492r。PCR 扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保温。

2实验结果

2.1纤维堆囊菌的分离纯化——形态观察

可以观察到子实体在滤纸上大量堆积，培养基中3～5成团，20～200μm，呈黄色、橙红色、棕黄色、铁锈色、黑色；营养细胞呈圆柱状，末端钝圆，长2.5～10μm；粘孢子在形态上与营养细胞区别小，长1～3μm；其扩展菌膜辐射状或扇状，边缘通常有树枝状或其它不规则突起。如图1，符合纤维堆囊菌形态学上的特征。

A B

C

图1 不同生长周期的纤维堆囊菌（5×）

A在滤纸上刚刚完成富集；B扩展到滤纸边缘的营养细胞；C营养细胞在琼脂上完成富集，形成大量子实体

2.2纤维堆囊菌的分离纯化-分子生物学鉴定

纯化的纤维堆囊菌16S rDNA序列与NCBI上的基因序列相比较，相似性都在98%以上。

3讨论

结合纤维堆囊菌特殊的生长特点：（1）菌体细胞可聚集形成肉眼可见的子实体结构；（2）在贫瘠的培养基上易形成扩展的菌落；（3）粘细菌的子实体或粘孢子具有较高的耐热性。本文创新性地使用了抗生素洗涤法与高温处理法相结合，大大提高了纯化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性较差，而将二甲亚砜作为溶剂加入培养基中又严重影响纤维堆囊菌的生长且有刺激性气味。故有必要找出能够替代制霉菌素的抗生素，最终发现用水溶性较好且相对浓度较高的放线菌酮对子实体进行洗涤，可以达到同样的抑制霉菌的效果。结合纤维堆囊菌的子实体耐高温这一相对优势生理特点对其进行高温水浴，在抑制甚至杀死其它杂菌的同时又不影响纤维堆囊菌的生长。

通过此方法，使纤维堆囊菌的纯化时间由之前的半年甚至一年缩短至一到两个月。相对于微生物的传统纯化方法和粘细菌的其他纯化方法，本文的试验方法简单高效，为纤维堆囊菌资源提供更加丰富和多样的研究材料，同时也为大量获得埃博霉素（Epothilones）及其结构类似物提供更多的原始产生菌。

参考文献：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint