肿瘤相关巨噬细胞模型建立的实验研究

张国良， 刘鹥雯， 何怡青， 杨翠霞， 王文涓， 杜 艳， 高 锋

(上海交通大学附属第六人民医院中心实验室，上海200233)

恶性肿瘤发生时，外周血单核细胞浸润至肿瘤间质，逐步被诱导分化为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)。近年研究发现TAM不具有杀伤肿瘤细胞的功能，反而能促进肿瘤生长和发展，其表型特征和功能与M2型巨噬细胞极为相似，是一种“促进肿瘤进展的 M2型巨噬细胞”［1］。TAM是肿瘤间质中的主要免疫细胞，临床研究表明TAM数量与肿瘤患者的预后呈负相关［2］，利用基因或治疗性方法清除肿瘤局部的TAM将会抑制肿瘤进展［3-4］。然而，目前缺少一种理想的TAM细胞模型来进行相关机制的研究。

在研究TAM与肿瘤细胞相互作用机制的体外试验中，目前应用最多的是利用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)和白细胞介素13(interleukin 13，IL-13)诱导的THP-1细胞作为TAM模型。在本研究中，我们利用IL-4和IL-13刺激新鲜分离的人外周血单核细胞，通过检测单核细胞表面的分子标志(CD14、CD204和CD206)、分泌的细胞因子及其杀伤功能的变化来确定其是否分化为TAM，以探索能模拟肿瘤微环境中TAM的细胞模型，便于展开相关研究。

材料和方法

一、试剂和仪器

人乳腺癌细胞株BT-549(中国科学院典型培养物保藏中心);RPMI1640培养液、胎牛血清(Gibco，美国);别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)-抗CD14抗体及同型对照抗体、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒 (eBioscience，美国)，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)-抗CD204抗体及同型对照抗体(R＆D，美国)，PE-抗 CD206抗体及同型对照抗体(Biolegend，美国);Hoechst 33342(碧云天，中国);流式细胞仪(Beckman Coulter，CA，美国);倒置荧光显微镜(Olympus IX70，日本)。

二、方法

1.分离人外周血单核细胞 取正常人体检抗凝血，加入等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)充分混匀，将稀释的全血按2∶1比例缓慢沿试管壁铺在淋巴细胞分离液上，室温下1 500×g离心20 min，小心吸出中间的云雾层细胞至另一离心管中，用RPMI1640培养液500×g离心10 min洗涤2次。将洗涤后的细胞重悬于含10%胎牛血清以及100 U/mL青、链霉素的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为5×106/mL，台盼兰拒染试验示活细胞＞95%。将细胞按以上浓度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱培养2～4 h后吸出培养基，用37℃预热的培养液清洗3次，将未贴壁细胞洗脱。

2.单核细胞诱导分化 上述贴壁细胞经乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)消化后离心，弃上清后重悬，接种5×105个单核细胞于T25培养瓶中，对照组为正常培养，实验组加入IL-4和IL-13刺激。IL-4和IL-13浓度均为20μg/mL［5］。确定 IL-4和 IL-13刺激时间的预实验如下:用上述浓度的IL-4和IL-13分别刺激单核细胞，分别在3、4、5和6 d时用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测其表面分子标志物的表达。结果显示，单核细胞表面CD204和CD206的表达在IL-4和IL-13刺激5 d后明显增加。因此，在正式实验中我们用20 ng/mL的IL-4和IL-13刺激单核细胞5 d，诱导其分化。

3.FCM检测单核细胞表面特异性抗原 实验分为常规培养组和IL-4/IL-13诱导组。单核细胞经EDTA消化后离心，弃上清后用PBS洗涤2次，计数，2组细胞均按每管约106个细胞的数量，分别收集至2个EP管中，其中实验管加入适量鼠抗人CD14单克隆抗体，对照管加入等体积CD14同型对照抗体，室温避光温育30 min，PBS洗涤2次，500μL PBS重悬，移至流式测试管中，上机检测。应用同样方法检测单核细胞表面CD204和CD206的表达。

4.ELISA检测单核细胞分泌的IL-10 将分离的单核细胞接种于24孔板(2×105/孔)，对照孔为正常培养孔，实验孔加入IL-4和IL-13(均为20 ng/mL)，培养5 d后收集上清，离心去沉渣后冻存于－20℃冰箱。按上述方法收集3次单核细胞上清，每次均为3复孔，然后按照ELISA试剂盒说明书提供的步骤检测上清中的IL-10含量。

5.BT-549细胞转染红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP) 将处于对数生长期的BT-549细胞接种于6孔板(2×105/孔)，待24h细胞生长至40%～50%融合时准备转染，弃去上清，于6孔板的每孔中加入含低浓度胎牛血清(＜10%)的RPMI1640培养基1mL，按感染复数(multiplicity，MOI)5、10、15、20 加入不同滴度的慢病毒颗粒(Lentivirus-RFP)，同时加入聚凝胺(终浓度5μg/mL)，充分摇匀后置37℃、5%CO2细胞培养箱中。作用8～12 h后用PBS洗涤细胞，加入10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，24、48和72h后在荧光显微镜下观察转染细胞的红色荧光和细胞毒性反应，以此确定大致转染效率(最佳点时拍照)。利用嘌呤霉素筛选阳性细胞，每隔2～3天加1次抗菌药物，连续筛选2～3次，之后继续培养、传代扩增，建立稳定的细胞株。

6.Hoechst染色检测肿瘤细胞凋亡 将分离的单核细胞接种于24孔板(5×104/孔)，对照孔为正常培养孔，实验孔加入IL-4和IL-13(均为20 ng/mL)，培养5 d后弃上清，EDTA消化后离心，弃上清后用RPMI1640培养液重悬，将其分别加入事先接种RFP-BT-549细胞的(2×104/孔，培养24h)24孔板中。2种细胞共培养24h后，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤后加入适量Hoechst 33342染液，4℃避光温育过夜。观察之前PBS洗涤3次，荧光显微镜下细胞核浓缩、染色致密者即为处于凋亡状态的肿瘤细胞，计数。

三、统计学方法

结 果

一、外周血单核细胞鉴定

分离人外周血单核细胞后，利用FCM检测单核细胞表面特异标志物CD14的表达率，以确定其纯度。结果显示所分离单核细胞的CD14表达率为97.56%±1.85%。见图1。

二、IL-4/IL-13诱导单核细胞表达TAM标志分子

正常培养组单核细胞表面CD204和CD206的表达率均较低，IL-4/IL-13(20 ng/mL)诱导组单核细胞表面CD204和CD206的表达率均显著增高(P＜0.001)，CD14的表达率无明显差异。见图2。

图1 人外周血单核细胞表面CD14表达

图2 单核细胞表面CD14、CD204和CD206的表达

三、IL-4/IL-13促进单核细胞分泌IL-10

常规培养组单核细胞的IL-10分泌量较低［(6.19±3.12)ng/mL］，IL-4/IL-13(20 ng/mL)刺激组单核细胞的IL-10分泌量显著增加［(18.63±10.20)ng/mL，P＜0.05］。见图3。

四、TAM对肿瘤细胞的杀伤功能

常规培养的RFP-BT-549细胞未观察到凋亡现象;RFP-BT-549细胞与正常单核细胞共培养后，出现大量的凋亡细胞;当RFP-BT-549细胞与IL-4/IL-13诱导后的单核细胞共培养时，RFPBT-549细胞的凋亡率显著降低(P＜0.001)。见图4。

图3 ELISA检测单核细胞IL-10的分泌量

图4 Hoechst染色观察肿瘤细胞凋亡

讨 论

TAM在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，可表现在多个环节，其中包括分泌多种生长因子，促进肿瘤细胞的生长［6-7］;分泌多种蛋白酶，破坏肿瘤细胞周围的基底膜，从而间接促进肿瘤细胞向周围组织侵袭［8-9］;分泌大量促进血管生成的细胞因子和调节血管生成的酶类，并可表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-C和 VEGF-D，从而促进肿瘤血管和淋巴管的生成［10-12］;与肿瘤化疗耐药性密切相关［13-14］。TAM已成为抗肿瘤治疗的作用靶点，而TAM与肿瘤细胞相互作用机制也成为近年研究的热点，但目前缺乏一种理想的TAM细胞模型。现有研究手段主要利用商品化的人外周血单核白血病细胞株THP-1作为巨噬细胞分化的模型，在PMA及IL-4/IL-13的作用下可分化为具有M2表型的巨噬细胞，以作为TAM模型。在体外实验中，将该TAM模型与肿瘤细胞共培养，研究其相互作用及机制［15-16］。然而，THP-1细胞是一种幼稚的单核白血病细胞，处于低分化状态，并不具备人外周血单核细胞所具有的各项免疫学功能。虽然THP-1细胞在PMA及IL-4/IL-13的诱导下可呈现M2型巨噬细胞的表型，但在功能方面并不能模拟单核细胞来源的TAM，因此用其作为TAM模型并不能真正模拟肿瘤微环境中的TAM。

在本研究中，我们分离健康人外周血单核细胞，并利用FCM检测分离纯度。利用IL-4/IL-13刺激纯化的单核细胞后，发现其表面标志物CD204、CD206表达明显增高，IL-10的分泌量也显著升高。CD204是巨噬细胞清道夫受体1(macrophage scavenger receptor 1，MSR1)，CD206是巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor，MMR);IL-10是一种抑制炎性反应的细胞因子，可下调巨噬细胞表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ以及协同刺激分子CD80和CD86的表达，使其抗原呈递能力降低，并可抑制巨噬细胞分泌炎性细胞因子和化学因子，使其促炎症能力降低［17］。通过经典途径激活的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)低表达CD204和CD206，其IL-10的分泌量也较低。而在肿瘤微环境中各种因素的作用下，TAM高表达 CD204和 CD206，并分泌较多的 IL-10［18-19］。本研究中，经IL-4/IL-13诱导的单核细胞高表达CD204和CD206，其IL-10分泌量也显著增高，呈现出TAM的表型。

与表型改变相比，TAM的功能改变同样重要。TAM呈现M2型巨噬细胞的功能，失去了对肿瘤的杀伤能力。本研究结果显示，与对照细胞相比，IL-4/IL-13诱导的单核细胞对肿瘤细胞的杀伤能力显著降低，从而证实其具有TAM的功能。据报道，人外周血单核细胞经巨噬细胞集落刺激因子诱导5～7 d后再经IL-4/IL-13诱导3 d可作为TAM模型［5］。本研究利用IL-4/IL-13诱导人外周血单核细胞5 d后也可使其呈现TAM的表型和功能，与现有方法相比，缩减了步骤和时间，可操作性更强，但还需进一步的实验验证该TAM模型的稳定性和实用性，以便未来广泛的应用。

综上所述，本研究已成功建立了TAM体外分化的细胞模型，与利用THP-1细胞建立的TAM模型相比，本研究利用人外周血单核细胞建立的TAM模型在表型及功能方面更能模拟肿瘤微环境中的TAM，可用于研究TAM与肿瘤细胞之间的相互作用及其机制。

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