2011至2013年仁济医院神经外科病房分离的鲍曼不动杆菌的耐药性变迁与同源性分析

陈艺升， 应春妹， 李永丽

(上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海200127)

鲍曼不动杆菌是一种临床常见的革兰阴性非发酵菌，是引起院内感染的主要条件致病菌之一。近年来，鲍曼不动杆菌分离率不断增加，尤其是耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapenems resistant Acinetobacter baumannii)，且此类菌株往往同时对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等抗菌药物耐药，给临床治疗带来极大困难。此外，耐药株极易爆发流行，尤其是在神经外科和重症监护病房［1］。为了解仁济医院神经外科病房鲍曼不动杆菌耐药性变迁和分子流行特征，本研究收集2011年7月至2013年6月神经外科病房临床分离的鲍曼不动杆菌共87株，采用琼脂稀释法检测其对临床常用抗菌药物的敏感性，多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技术对其进行基因型别分析，了解神经外科近年来分离的鲍曼不动杆菌耐药性变迁和主要基因型别，为指导临床用药和控制医院感染提供依据。

材料和方法

一、材料

1.菌株 收集仁济医院2011年7月至2013年6月神经外科分离的鲍曼不动杆菌共87株，剔除同一患者重复标本。所有菌株均采用西门子Micro Scan WalkAway 96 plus细菌鉴定仪鉴定。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC 25922)和铜绿假单胞菌(ATCC 27853)。

2.仪器与试剂 Micro Scan WalkAway 96 plus细菌鉴定仪(西门子公司，德国);veriti 96孔梯度聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(ABI，美国);琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad);凝胶成像系统(上海天能技术有限公司);哌拉西林、他唑巴坦、头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、米诺环素、环丙沙星、磺胺甲口恶唑、甲氧苄啶等抗菌药物购自上海科佳药检器材公司;头孢肶肟由上海施贵宝制药有限公司惠赠;亚胺培南由杭州默沙东制药有限公司惠赠。

二、方法

1.体外药物敏感性试验 采用琼脂稀释法检测87株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，结果判读参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012年标准［2］。

2.MLST 从血平板上挑取单个菌落于300μL 0.85%的生理盐水中，制成细菌悬液，以8 600×g离心5 min，弃上清液，加入300μL无菌双蒸水重悬细菌，100℃水浴15 min，12 000×g离心5 min，取上清液即为DNA模板。参照鲍曼不动杆菌 MLST数据库(http://pubmlst.org/abaumannii/)设计 gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和 rpoD 7个管家基因［3］引物序列，见表1，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR总反应体系为25μL，其中 10×PCR缓冲液(含MgCl2)2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，Taq 酶0.25 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.25 μL。反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s、52～56℃退火45 s、72℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定单一条带后，送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行双向测序。

表1 PCR引物序列和产物长度

结 果

一、药物敏感性试验

87株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物普遍耐药，对米诺环素的耐药率最低，为32.2%，对其它抗菌药物的耐药率均在70%以上;对磺胺甲口恶唑-甲氧苄啶耐药，见表2。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌67株，占77.0%。比较连续3年神经外科鲍曼不动杆菌耐药率变迁发现，除米诺环素耐药率略有降低外，对其余抗菌药物的耐药率均有上升趋势。

二、MLST

87株鲍曼不动杆菌可分为6个ST型，其中ST-208型 45株，占 51.7%;ST-191型 15株，占17.2%;ST-540型8株;ST-195型和ST-381型各2株;ST-368型1株;余下14株都至少有一个新的等位基因，无法鉴定ST型。除ST-381外，其余5种型别均属于CC92克隆群，具有基因同源性。ST-208型是仁济医院神经外科鲍曼不动杆菌的主要克隆流行株。综合87株鲍曼不动杆菌的MIC结果发现，ST-208型和ST-191型是耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的主要流行型别，是造成神经外科耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分离率高的重要原因。见表3。

表2 87株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物的耐药率

表3 ST基因型数量及构成比 ［株(%)］

讨 论

鲍曼不动杆菌是一种重要的医院感染条件致病菌，常引起肺炎、菌血症、尿路感染、继发性脑膜炎、手术部位感染等［4］。碳青霉烯类药物(如亚胺培南和美罗培南)是治疗鲍曼不动杆菌感染的首选药物，但是随着抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率均呈现上升趋势，使临床治疗和医院感染控制面临严峻挑战。2011年上海地区细菌耐药性监测结果显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为53%和55%［5］，同年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示对两者的耐药率为60.4%和61.4%［6］。

神经外科患者多存在较严重的基础疾病，感染鲍曼不动杆菌的耐药性也相对较高。本研究中分离的87株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物普遍耐药，对米诺环素的耐药率稍低，为32.2%，对其他抗菌药物的耐药率均在70.0%以上。87株鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率高达74.7%和80.5%，其中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌67株，占77.0%。进一步分析发现耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌往往同时对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等药物高度耐药。连续3年鲍曼不动杆菌耐药性变迁显示，除米诺环素外，对其它抗菌药物的耐药率均有逐年增加趋势。以亚胺培南为例，2011年的耐药率仅为59.3%，2012年上升至78.0%，而2013上半年的耐药率已高达89.5%。

耐药鲍曼不动杆菌极易造成医院感染流行，Bernards、Clímaco 等［7-8］均报道有鲍曼不动杆菌的院内流行，对菌株进行基因分型，分析不同型别之间的同源关系，有利于了解菌株流行特征，能够及时发现菌株爆发流行并采取控制措施。MLST技术是国际公认的型别鉴定方法，该法操作简便，可追溯菌株的同源性和传播性，且鉴定结果可用于不同实验室之间的比较。Huang等［9］对国内某家医院连续6年分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌进行MLST分型，发现存在CC92克隆株流行传播。Gurung等［10］近期的研究结果也发现院内ST-191型碳青霉烯类耐药株的播散。He等［11］的研究证实鲍曼不动杆菌CC92克隆群已在全国范围内流行。本研究中的87株鲍曼不动杆菌可分为6个 ST基因型，其中 ST-208型 45株(51.7%)，是神经外科的主要流行型别，其次是ST-191型(17.2%)。除 ST-381以外，其余5种型别均属于CC92克隆群，具有基因同源性。比较3年内神经外科鲍曼不动杆菌流行型别可知，ST-208一直是仁济医院神经外科最主要的流行型别，而ST-191型从2011年的3.7%上升到2012年的29.3%(12/41)，且在2013年也占有一定的比例，是一种新的流行株。结合MIC结果，67株碳青霉烯类耐药株中ST-208型(37株)和ST-191型(13株)占了64.1%，所以ST-208型和ST-191型的流行传播是导致仁济医院神经外科耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分离率高的重要原因。

本研究结果表明，仁济医院神经外科鲍曼不动杆菌耐药性严峻，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分离率高，且存在耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌克隆株传播。鉴于临床对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌尚缺乏良好的治疗方案，需加强耐药性监测及合理使用抗菌药物，提高医护人员消毒意识，避免此类菌株爆发流行。

［1］Fu Y，Zhou J，Zhou H，etal.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(4):644-650.

［2］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-first informational supplement［S］.M100-S22，CLSI，2012.

［3］苏运钦，叶聪秀，车玉传，等.多位点序列分型技术在鲍曼不动杆菌同源性分析中的应用［J］.中国抗生素杂志，2013，38(5):360-362.

［4］Peleg AY，Seifert H，Paterson DL，etal.Acinetobacter baumannii:emergence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(3):538-582.

［5］朱德妹，杨 洋，蒋晓飞，等.2011年上海地区细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2012，12(6):401-411.

［6］胡付品，朱德妹，汪 复，等.2011年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2012，12(5):321-329.

［7］Bernards AT，Harinck HI，Dijkshoorn L，etal.Persistent Acinetobacter baumannii?Look inside your medical equipment［J］. Infect Control Hosp Epidemiol，2004，25(11):1002-1004.

［8］Clímaco EC，Oliveira ML，Pitondo-Silva A，etal.Clonal complexes 104，109 and 113 playing a major role in the dissemination of OXA-carbapenemaseproducing Acinetobacter baumannii in Southeast Brazil［J］.Infect Genet Evol，2013，19:127-133.

［9］Huang L，Sun L，Yan Y.Clonal spread of carbapenem resistant Acinetobacter baumannii ST92 in a Chinese hospital during a 6-year period［J］.J Microbiol，2013，51(1):113-117.

［10］Gurung M，Rho JS，Lee YC，etal.Emergence and spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii sequence type 191 in a Korean hospital［J］.Infect Genet Evol，2013，19:219-222.

［11］He C，Xie Y，Fan H，etal.Spread of imipenemresistant Acinetobacter baumannii of European cloneⅡ in Western China［J］.Int J Antimicrob Agents，2011，38(3):257-260.