徐州采煤塌陷区复垦土壤的细菌群落多样性

摘要：为探讨江苏省徐州市采煤塌陷区土壤微生物群落多样性及优势种群在复垦前后的变化，利用454 焦磷酸测序法，对比分析采煤塌陷地、复垦地以及非塌陷对照地这3个样地的细菌多样性及群落结构。结果表明，变形菌、放线菌、浮霉菌、酸杆菌、绿弯菌、拟杆菌、厚壁菌和芽单胞菌为细菌的主要类群，但其在3个处理区的分布各不相同，即芽单胞菌和硝化螺旋菌在复垦区中分布最广，酸杆菌、放线菌、拟杆菌在对照区中最多，变形菌在塌陷区中分布最广。复垦地土壤的细菌群落多样性水平最高，对照地次之，塌陷地最低。细菌群落多样性指数与土壤有机质、全氮、速效钾的含量呈正相关关系，与土壤盐分呈负相关关系。开采沉陷导致土壤肥力退化和土壤盐渍化现象加重，抑制微生物的繁殖与生长。复垦与植被修复能够改善土壤理化特征，恢复微生物群落结构功能与多样性。

关键词：采煤塌陷区；复垦土壤；微生物；454 焦磷酸测序法；多样性

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：51174207）；江苏高校优势学科建设工程项目（编号：SZBF2011-6-B35）。

作者简介：李媛媛（1985—），女，江苏徐州人，博士研究生，主要从事矿区土地复垦与土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤会扰动人类活动等，不可避免地会改变土壤生态系统，破坏微生物群落生态功能稳定性。矿区土壤复垦及生态重建已成为全球土壤环境研究领域中的重要课题[1]。土壤微生物群落能敏锐地反映出生态环境的功能演变以及环境胁迫等影响，是衡量矿区土壤生态功能和监测矿区环境变化的有效指示器[2-3]。近年来，我国关于矿区生态恢复的研究取得了丰硕的成果，但主要集中于复垦土壤的物理特性、化学特征和重金属污染等方面[4-6]。有关复垦土壤的微生物群落特征的研究较少，特别是从分子水平对矿区土壤微生物群落结构及多样性的报道较为少见。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸测序法[7]，通过比较复垦地、塌陷地及对照地的土壤细菌多样性及群落结构等特征，探讨复垦以及植被恢复对土壤微生物群落的影响。一方面为454焦磷酸测序技术的应用提供试验方法和经验借鉴，另一方面将认识矿区土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，为土壤生态学研究提供了新视角，同时也为矿区生态恢复提供了信息和参考。

1材料与方法

1.1土壤样品采集与预处理

试验区设在江苏省徐州市柳新国家复垦示范项目区内，共包括复垦地、 塌陷地和对照地3个不同处理的采样区，取具代表性的泥浆泵复垦地以及塌陷未复垦地作为土样采集对象，并以未受影响的正常农田为对照。复垦区的土壤经泥浆泵复垦后，进行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三叶草以及黑麦草。复垦区与对照区具有相同的种植制度和施肥管理水平。在3个处理区内按照“S”形分别选取5个样点（重复3次采样），每个样点采集0～20 cm深度的土样，0～20 cm土层四边各取1/4土样，混合构成1个样（按同一处理进行归类）。各样区采回的土样风干过筛后充分混合，过2 mm筛后分装，保存于4、-80 ℃冰箱中，分别用于理化指标测定和DNA提取。

1.2土壤基本性质测定

按照文献[8]测定土壤的基本性质，其中有机质含量的测定采用重铬酸钾容量法（外加热法）；pH值的测定采用电导法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的测定采用半微量开氏法；全磷含量的测定采用 NaOH 熔融-钼锑抗比色法；速效钾含量的测定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤盐分含量使用托普生产的TZS-EC-I电导仪测定。土壤基本理化性质主要参数见表1。

1.3土样DNA提取、PCR扩增与测序

1.4数据处理与分析

本研究的数据处理与分析采用软件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2结果与分析

2.116S rRNA基因序列测序结果及细菌群落总体分布特征

454焦磷酸高通量测序共得到31 469条有效序列、26 717 条优化序列。复垦地、塌陷地与对照地分别得到优化序列10 103、10 450、6 164条，平均长度为474 bp。如图1所示，土壤细菌主要由变形菌 （35.00%）、放线菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸杆菌（6.45%）、绿弯菌 （6.02%）、拟杆菌 （464%）、芽单胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）组成。这些菌群在3个处理区的所有样品中均有分布，与已有研究结果[9-11]一致。其中，变形菌门占绝对优势，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同样，Tait等在对美国马萨诸塞州礁湖土壤细菌的研究中发现，72% 的细菌属于变形菌门[9]；Kolton等在对不同土壤系统的研究中也揭示了变形菌门为最具优势的土壤细菌类群[10]。这说明变形菌门在维持土壤生态系统功能中扮演着重要的角色，其在土壤中的广泛分布占据了微生物群落组成的主要部分。变形菌门主要以4种变形菌亚群γ-变形菌、α-变形菌、β-变形菌、δ-变形菌纲为主，其中γ-变形菌占绝对主导地位，为不同环境矿区土壤的广适类群。与本研究结果不同的是，Roesch 等通过对土壤细菌样品的测序分析得出，在变形菌门中最具优势的变形菌亚门为β-变形菌[11]。

2.2土壤细菌群落的多样性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通过多样性指数的非参数分析对比不同处理土壤的物种丰度与多度，结果如表2所示。如表2所示，细菌多样性水平在不同处理区从大到小依次为复垦地>对照地>塌陷地。复垦地的土壤微生物群落DNA序列的丰富度、均匀度和多样性指数最高，对照地次之，而未复垦裸地的物种多样性指数明显最低。

2.3土壤理化性质与细菌多样性的相关分析

如表3所示，塌陷地土壤的有机质、全氮、全磷、速效钾含量均低于对照地，说明开采沉陷造成塌陷区土壤肥力下降，造成其有机质以及氮、磷等土壤养分元素的流失。endprint

摘要：为探讨江苏省徐州市采煤塌陷区土壤微生物群落多样性及优势种群在复垦前后的变化，利用454 焦磷酸测序法，对比分析采煤塌陷地、复垦地以及非塌陷对照地这3个样地的细菌多样性及群落结构。结果表明，变形菌、放线菌、浮霉菌、酸杆菌、绿弯菌、拟杆菌、厚壁菌和芽单胞菌为细菌的主要类群，但其在3个处理区的分布各不相同，即芽单胞菌和硝化螺旋菌在复垦区中分布最广，酸杆菌、放线菌、拟杆菌在对照区中最多，变形菌在塌陷区中分布最广。复垦地土壤的细菌群落多样性水平最高，对照地次之，塌陷地最低。细菌群落多样性指数与土壤有机质、全氮、速效钾的含量呈正相关关系，与土壤盐分呈负相关关系。开采沉陷导致土壤肥力退化和土壤盐渍化现象加重，抑制微生物的繁殖与生长。复垦与植被修复能够改善土壤理化特征，恢复微生物群落结构功能与多样性。

关键词：采煤塌陷区；复垦土壤；微生物；454 焦磷酸测序法；多样性

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：51174207）；江苏高校优势学科建设工程项目（编号：SZBF2011-6-B35）。

作者简介：李媛媛（1985—），女，江苏徐州人，博士研究生，主要从事矿区土地复垦与土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤会扰动人类活动等，不可避免地会改变土壤生态系统，破坏微生物群落生态功能稳定性。矿区土壤复垦及生态重建已成为全球土壤环境研究领域中的重要课题[1]。土壤微生物群落能敏锐地反映出生态环境的功能演变以及环境胁迫等影响，是衡量矿区土壤生态功能和监测矿区环境变化的有效指示器[2-3]。近年来，我国关于矿区生态恢复的研究取得了丰硕的成果，但主要集中于复垦土壤的物理特性、化学特征和重金属污染等方面[4-6]。有关复垦土壤的微生物群落特征的研究较少，特别是从分子水平对矿区土壤微生物群落结构及多样性的报道较为少见。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸测序法[7]，通过比较复垦地、塌陷地及对照地的土壤细菌多样性及群落结构等特征，探讨复垦以及植被恢复对土壤微生物群落的影响。一方面为454焦磷酸测序技术的应用提供试验方法和经验借鉴，另一方面将认识矿区土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，为土壤生态学研究提供了新视角，同时也为矿区生态恢复提供了信息和参考。

1材料与方法

1.1土壤样品采集与预处理

试验区设在江苏省徐州市柳新国家复垦示范项目区内，共包括复垦地、 塌陷地和对照地3个不同处理的采样区，取具代表性的泥浆泵复垦地以及塌陷未复垦地作为土样采集对象，并以未受影响的正常农田为对照。复垦区的土壤经泥浆泵复垦后，进行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三叶草以及黑麦草。复垦区与对照区具有相同的种植制度和施肥管理水平。在3个处理区内按照“S”形分别选取5个样点（重复3次采样），每个样点采集0～20 cm深度的土样，0～20 cm土层四边各取1/4土样，混合构成1个样（按同一处理进行归类）。各样区采回的土样风干过筛后充分混合，过2 mm筛后分装，保存于4、-80 ℃冰箱中，分别用于理化指标测定和DNA提取。

1.2土壤基本性质测定

按照文献[8]测定土壤的基本性质，其中有机质含量的测定采用重铬酸钾容量法（外加热法）；pH值的测定采用电导法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的测定采用半微量开氏法；全磷含量的测定采用 NaOH 熔融-钼锑抗比色法；速效钾含量的测定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤盐分含量使用托普生产的TZS-EC-I电导仪测定。土壤基本理化性质主要参数见表1。

1.3土样DNA提取、PCR扩增与测序

1.4数据处理与分析

本研究的数据处理与分析采用软件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2结果与分析

2.116S rRNA基因序列测序结果及细菌群落总体分布特征

454焦磷酸高通量测序共得到31 469条有效序列、26 717 条优化序列。复垦地、塌陷地与对照地分别得到优化序列10 103、10 450、6 164条，平均长度为474 bp。如图1所示，土壤细菌主要由变形菌 （35.00%）、放线菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸杆菌（6.45%）、绿弯菌 （6.02%）、拟杆菌 （464%）、芽单胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）组成。这些菌群在3个处理区的所有样品中均有分布，与已有研究结果[9-11]一致。其中，变形菌门占绝对优势，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同样，Tait等在对美国马萨诸塞州礁湖土壤细菌的研究中发现，72% 的细菌属于变形菌门[9]；Kolton等在对不同土壤系统的研究中也揭示了变形菌门为最具优势的土壤细菌类群[10]。这说明变形菌门在维持土壤生态系统功能中扮演着重要的角色，其在土壤中的广泛分布占据了微生物群落组成的主要部分。变形菌门主要以4种变形菌亚群γ-变形菌、α-变形菌、β-变形菌、δ-变形菌纲为主，其中γ-变形菌占绝对主导地位，为不同环境矿区土壤的广适类群。与本研究结果不同的是，Roesch 等通过对土壤细菌样品的测序分析得出，在变形菌门中最具优势的变形菌亚门为β-变形菌[11]。

2.2土壤细菌群落的多样性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通过多样性指数的非参数分析对比不同处理土壤的物种丰度与多度，结果如表2所示。如表2所示，细菌多样性水平在不同处理区从大到小依次为复垦地>对照地>塌陷地。复垦地的土壤微生物群落DNA序列的丰富度、均匀度和多样性指数最高，对照地次之，而未复垦裸地的物种多样性指数明显最低。

2.3土壤理化性质与细菌多样性的相关分析

如表3所示，塌陷地土壤的有机质、全氮、全磷、速效钾含量均低于对照地，说明开采沉陷造成塌陷区土壤肥力下降，造成其有机质以及氮、磷等土壤养分元素的流失。endprint

摘要：为探讨江苏省徐州市采煤塌陷区土壤微生物群落多样性及优势种群在复垦前后的变化，利用454 焦磷酸测序法，对比分析采煤塌陷地、复垦地以及非塌陷对照地这3个样地的细菌多样性及群落结构。结果表明，变形菌、放线菌、浮霉菌、酸杆菌、绿弯菌、拟杆菌、厚壁菌和芽单胞菌为细菌的主要类群，但其在3个处理区的分布各不相同，即芽单胞菌和硝化螺旋菌在复垦区中分布最广，酸杆菌、放线菌、拟杆菌在对照区中最多，变形菌在塌陷区中分布最广。复垦地土壤的细菌群落多样性水平最高，对照地次之，塌陷地最低。细菌群落多样性指数与土壤有机质、全氮、速效钾的含量呈正相关关系，与土壤盐分呈负相关关系。开采沉陷导致土壤肥力退化和土壤盐渍化现象加重，抑制微生物的繁殖与生长。复垦与植被修复能够改善土壤理化特征，恢复微生物群落结构功能与多样性。

关键词：采煤塌陷区；复垦土壤；微生物；454 焦磷酸测序法；多样性

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金项目：国家自然科学基金（编号：51174207）；江苏高校优势学科建设工程项目（编号：SZBF2011-6-B35）。

作者简介：李媛媛（1985—），女，江苏徐州人，博士研究生，主要从事矿区土地复垦与土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤会扰动人类活动等，不可避免地会改变土壤生态系统，破坏微生物群落生态功能稳定性。矿区土壤复垦及生态重建已成为全球土壤环境研究领域中的重要课题[1]。土壤微生物群落能敏锐地反映出生态环境的功能演变以及环境胁迫等影响，是衡量矿区土壤生态功能和监测矿区环境变化的有效指示器[2-3]。近年来，我国关于矿区生态恢复的研究取得了丰硕的成果，但主要集中于复垦土壤的物理特性、化学特征和重金属污染等方面[4-6]。有关复垦土壤的微生物群落特征的研究较少，特别是从分子水平对矿区土壤微生物群落结构及多样性的报道较为少见。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸测序法[7]，通过比较复垦地、塌陷地及对照地的土壤细菌多样性及群落结构等特征，探讨复垦以及植被恢复对土壤微生物群落的影响。一方面为454焦磷酸测序技术的应用提供试验方法和经验借鉴，另一方面将认识矿区土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，为土壤生态学研究提供了新视角，同时也为矿区生态恢复提供了信息和参考。

1材料与方法

1.1土壤样品采集与预处理

试验区设在江苏省徐州市柳新国家复垦示范项目区内，共包括复垦地、 塌陷地和对照地3个不同处理的采样区，取具代表性的泥浆泵复垦地以及塌陷未复垦地作为土样采集对象，并以未受影响的正常农田为对照。复垦区的土壤经泥浆泵复垦后，进行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三叶草以及黑麦草。复垦区与对照区具有相同的种植制度和施肥管理水平。在3个处理区内按照“S”形分别选取5个样点（重复3次采样），每个样点采集0～20 cm深度的土样，0～20 cm土层四边各取1/4土样，混合构成1个样（按同一处理进行归类）。各样区采回的土样风干过筛后充分混合，过2 mm筛后分装，保存于4、-80 ℃冰箱中，分别用于理化指标测定和DNA提取。

1.2土壤基本性质测定

按照文献[8]测定土壤的基本性质，其中有机质含量的测定采用重铬酸钾容量法（外加热法）；pH值的测定采用电导法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的测定采用半微量开氏法；全磷含量的测定采用 NaOH 熔融-钼锑抗比色法；速效钾含量的测定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤盐分含量使用托普生产的TZS-EC-I电导仪测定。土壤基本理化性质主要参数见表1。

1.3土样DNA提取、PCR扩增与测序

1.4数据处理与分析

本研究的数据处理与分析采用软件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2结果与分析

2.116S rRNA基因序列测序结果及细菌群落总体分布特征

454焦磷酸高通量测序共得到31 469条有效序列、26 717 条优化序列。复垦地、塌陷地与对照地分别得到优化序列10 103、10 450、6 164条，平均长度为474 bp。如图1所示，土壤细菌主要由变形菌 （35.00%）、放线菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸杆菌（6.45%）、绿弯菌 （6.02%）、拟杆菌 （464%）、芽单胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）组成。这些菌群在3个处理区的所有样品中均有分布，与已有研究结果[9-11]一致。其中，变形菌门占绝对优势，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同样，Tait等在对美国马萨诸塞州礁湖土壤细菌的研究中发现，72% 的细菌属于变形菌门[9]；Kolton等在对不同土壤系统的研究中也揭示了变形菌门为最具优势的土壤细菌类群[10]。这说明变形菌门在维持土壤生态系统功能中扮演着重要的角色，其在土壤中的广泛分布占据了微生物群落组成的主要部分。变形菌门主要以4种变形菌亚群γ-变形菌、α-变形菌、β-变形菌、δ-变形菌纲为主，其中γ-变形菌占绝对主导地位，为不同环境矿区土壤的广适类群。与本研究结果不同的是，Roesch 等通过对土壤细菌样品的测序分析得出，在变形菌门中最具优势的变形菌亚门为β-变形菌[11]。

2.2土壤细菌群落的多样性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通过多样性指数的非参数分析对比不同处理土壤的物种丰度与多度，结果如表2所示。如表2所示，细菌多样性水平在不同处理区从大到小依次为复垦地>对照地>塌陷地。复垦地的土壤微生物群落DNA序列的丰富度、均匀度和多样性指数最高，对照地次之，而未复垦裸地的物种多样性指数明显最低。

2.3土壤理化性质与细菌多样性的相关分析

如表3所示，塌陷地土壤的有机质、全氮、全磷、速效钾含量均低于对照地，说明开采沉陷造成塌陷区土壤肥力下降，造成其有机质以及氮、磷等土壤养分元素的流失。endprint