HPLC法测定不同产地山里红中表儿茶素含量

★ 邵峰 谷丽菲 刘荣华＊ 黄慧莲 陈慧娟 江东龙 (江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 江西南昌330004)

山楂为蔷微科山楂属植物山里红(Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.)或山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果实，具有消食健胃、行气散瘀，等功效，临床常用于治疗肉食积滞、胃脘胀满、泻痢腹痛、瘀血经闭，等病症［1］。作为黄烷醇类化合物，表儿茶素具有保护心肌［2］、降血脂［3，4］以及对抗胆酸引起的肝细胞凋亡［5］，等药效作用。鉴于此，本研究采用HPLC法，对不同产地山里红中的表儿茶素进行含量测定，为建立山里红质量控制方法提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国，VWD检测器，1260化学工作站)，BT25S型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，BT5S型万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，N－1001型旋转蒸发器(东京理化器械(株)独资工厂)，KQ－300VDB型双频数控超声清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 表儿茶素对照品(批号:110878－200102)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈(色谱纯)购自美国Dikma公司，磷酸(分析纯)购自西陇化工股份有限公司，双蒸水(实验室自制)。

山里红采集时间为2012年11月，所有药材经江西中医药大学刘荣华教授鉴定，保存于江西中医药大学标本馆，见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取表儿茶素6.5mg，置于10mL容量瓶中，加入8%甲醇溶液定容至刻度，得到浓度为 0.65mg/mL的对照品母液，经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

2.2 供试品溶液制备 称取干燥的山里红样品100g，经粉碎，加入70%的乙醇500mL，在70℃条件下回流提取3次，每次1h，经过滤，合并滤液，减压回收溶剂，得到山里红总提取物。取一定量的的山里红总提取物置于10mL容量瓶中，加甲醇，超声提取30min，放置室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜，得到供试品溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱YMC－Triart C18(250mm×4.6mm，5μm);流动相:乙腈(A)～0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，0 ～10min，8% ～15%A;10 ～30min，15% ～15%A。流速1mL/min，检测波长280nm，柱温25℃，进样量20μL。理论塔板数大于3000，见图1。

图1 山里红HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取溶液浓度分别为0.00166，0.0166，0.083，0.166，0.83，1.00mg/mL 表儿茶素对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积。以进样浓度(mg/mL)为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，得标准曲线，建立表儿茶素回归方程，即 Y=11741X － 12.712，r=0.9993，在0.00166～1.00mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取表儿茶素对照品溶液20μL，按“2.3”项下色谱条件，连续进样6 次，计算峰面积的RSD为0.043%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按“2.2”项方法制备供试品溶液及“2.3”项下色谱条件，分别在第0，2，4，6，8，10h 间隔进样 20μL，测得表儿茶素峰面积积分值，计算供试品 RSD为1.92%，表明样品在10h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一产地山里红样品，按“2.2”项方法制备供试品溶液 6份及“2.3”项下色谱条件，进样20μL，测得表儿茶素的峰面积积分值，计算供试品RSD为2.51%，表明样品制备方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 取已知表儿茶素含量的山东省临沂市沂水县产山里红药材6份，每份1.0g，精密称定，按“2.2”项方法制备供试品溶液，加入适量的表儿茶素对照品，按“2.3”项下色谱条件进样20μL，测定表儿茶素含量并计算回收率，见表2。

2.4.6 样品含量测定 精密吸取已制备的不同产地山里红待测溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定表儿茶素峰面积积分值，利用外标法分别计算表儿茶素的含量，结果表明:山里红中表儿茶素含量在0.04% ～0.21%范围内，其中，山东省青州市出产的山里红含量最高，山西省运城市绛县出产的山里红含量最低。见表3。

表2 表儿茶素加样回收率测定

表3 不同产地山里红中表儿茶素含量测定(n=3)

3 讨论

生物体内的氧自由基在心血管疾病的发生与发展方面起着重要的作用。本课题组曾研究发现，山楂叶中的表儿茶素对于羟自由基和过氧化氢具有较强的清除活性［6］。鉴于此，本研究在以往相关文献报道的基础上［7－9］，采用 HPLC 定量分析技术，建立山里红中表儿茶素含量测定的方法。该方法操作简单，准确，重复性好，易于推广。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典﹒一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:29.

［2］曹莹，梁日欣，杨滨，等.(－)－儿茶素没食子酸酯和(+)－表儿茶素对心肌细胞保护作用研究［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(10):36 －38.

［3］林亲录，施兆鹏，刘湘新，等.儿茶素和表儿茶素对动物血脂的影响［J］.中国食品学报，2002，2(3):16 －20.

［4］刘湘新，林亲录，施兆鹏，等.儿茶素和表儿茶素对小白鼠血清脂质的影响［J］.湖南农业大学学报(自然科学版)，2002，28(3):232－233.

［5］余晶，Vladim ir Khaoustov，徐玉敏，等.表儿茶素对牛磺酸脱氧胆酸诱导Huh7细胞凋亡的作用［J］.中国中药杂志，2009，34(10):1 272－1 275.

［6］刘荣华，陈兰英，朱根华，等.单籽山楂叶中多元酚类成分及其抗氧化活性研究［J］.中草药，2007，38(10):1 541 －1 544.

［7］刘建利，原江锋，阎娥，等.山楂多分含量的反相高效液相色谱法测定［J］.食品科学，2009，30(14):163 －166.

［8］陈承瑜，杨滨，周洁.山楂饮片的质量评价研究［J］.中国实验方剂学，2009，15(12):1 －3.

［9］章弘扬，张弛，王月荣，等.山楂中黄酮类成分的定性和定量分析［J］.中国中药杂志，2012，37(5):601 －604.