神安颗粒苷类成分的指纹图谱研究

★ 李坚 易延逵 蔡光先 杨永华 (1.涟源市人民医院药剂科 湖南 涟源417100;2.南方医科大学 广东 广州510515;.湖南中医药大学 湖南长沙410006)

天然产物指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它是建立在天然产物化学成分系统研究的基础上，主要用于评价天然产物及其半成品、成品质量的真实性、优良性和稳定性。目前指纹图谱已成为国际公认的控制天然产物(尤其是中药)质量的最有效手段［1－3］。

神安颗粒是由天麻、五味子、丹参、百合花、酸枣仁、首乌藤等组成，具有补脑安神、宁心除烦之功效。其基本工艺为:天麻粉碎成微粉;丹参、五味子、百合花加90%乙醇渗漉提取其极性较小脂溶性成分;丹参、五味子、百合花醇提后药渣与酸枣仁、夜交藤加水提取，最后加入适量辅料制成颗粒。神安颗粒主要成分如下几类:以天麻素为代表的较高极性苷类成分;存在于丹参、五味子、百合花中的丹参醌类、五味子木脂素类成分、百合花色素类等脂溶性成分;另含有以斯皮诺素为代表的苷类成分，丹参素类成分。神安颗粒所含成分较复杂，要想制定其指纹图谱可采用制定其“全指纹图谱系”来全面控制其质量。神安颗粒的“全指纹图谱系”应有以上各类成分的信息。本文主要探讨神安颗粒中以天麻素为代表的苷类成分指纹图谱的制定。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent数据处理软件;SK1200H型超声器(上海科导超声仪器有限公司);

天麻素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736－200423，供含量测定用);磷酸为色谱纯试剂(Fisher)，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

天麻、五味子、丹参、百合花、酸枣仁、首乌藤等药材(长沙海川医药有限公司)，神安颗粒(自制)。

2 方法与结果

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)，参照指纹图谱的有关技术要求进行测定［4］。

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:C18柱;流动相:0.05%磷酸溶液;检测波长:220nm。理论板数按天麻素峰计算应不低于5000［5］。

2.1.2 供试品溶液的制备 取神安颗粒0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇10mL，精密称定，超声(功率200W，频率40kHz)提取 30min，放冷，再精密称定重量，减失的重量用稀乙醇补足，滤过，取续滤液5mL，浓缩至近干，残渣加稀乙醇溶解，转移至10mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3 参照物的选择和制备

神安颗粒中苷类成分主要为天麻中的苷类成分，天麻素为天麻的指标成分，因而选用天麻素为参照物。

对照品溶液的制备:精密称取天麻素对照品(80℃干燥1h)适量，加流动相制成每1mL中含天麻素50μg的溶液，即得。

2.1.4 测定法

分别精密吸取参照物溶液10μL与供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，记录时间为50min。以天麻素的色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1计算其它各峰相对保留时间和相对峰面积。相似度评价采用“中药色谱指纹图谱相似性评价系统”进行。

表1 十批神安颗粒样品中苷类成分各共有峰的相对保留时间

图1 HPLC图谱

2.1.5 神安颗粒中苷类成分指纹图谱的建立(1)共有指纹峰的标定 共有指纹峰采用相对保留时间标定，以图谱中天麻素为参照物，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物天麻素的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，计算神安颗粒10个批次指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间，结果见表1。其中5个色谱峰为各批次神安颗粒所共有，故标定它们为共有指纹峰，结果见图1。5个共有指纹峰的相对保留时间分别为峰－1(0.2558～0.2566)、峰 － 2(0.3481 ～ 0.3521)、峰 － 3(0.4429 ～0.4446)、峰 －4(0.4963 ～0.5016)、峰 －S(1.0000)。

(2)共有指纹峰的相对峰面积 以图谱中天麻素为参照物，将各色谱峰峰面积与同一图谱中参照物天麻素的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积，结果见表2。因神安颗粒中苷类成分指纹图谱峰数少，对单峰峰面积占总峰面积＜10%的共有峰也进行了计算。

表2 十批神安颗粒样品中苷类成分各共有峰的相对峰面积

(3)相似度评价 相似度评价采用“中药色谱指纹图谱相似性评价系统”，自动谱峰匹配。结果见图2。结果10批样品的相似度均在0.80以上。

图2 相似度计算(全谱)图

2.1.6 方法学考查 (1)精密度试验 取同一份神安颗粒的供试品溶液，连续测定5次，对色谱中各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，结果各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，结果见表3～4。结果符合指纹图谱精密度的要求(RSD＜2%)。

表3 相对保留时间精密度结果(n=5)

(2)重复性试验取同一批神安颗粒样品5份，分别按“2.1.2项下供试品溶液制备方法”制备成供试品溶液，依法测定，对色谱中各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积进行统计，结果各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积基本一致，结果见表5～6。符合指纹图谱重复性的要求(RSD＜2%)。

表4 相对峰面积精密度结果(n=5)

表5 相对保留时间重复性结果(n=5)

表6 相对峰面积重复性结果(n=5)

(3)稳定性试验取同一份神安颗粒的供试品溶液，分别在以下时间进样:0，2，4，6，8h，对色谱中各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积结果进行统计，结果各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积基本一致，表明神安颗粒供试品溶液在8h内稳定，结果见表7～8。结果符合指纹图谱稳定性的要求(RSD＜2%)。

表7 相对保留时间稳定性结果(n=5)

表8 相对峰面积稳定性结果(n=5)

2.1.7 指纹图中指纹峰与药味的相关性考查 为了确定神安颗粒“全指纹图谱系”中苷类成分指纹图谱中指纹峰的来源，需要考查缺味神安颗粒和药材的指纹图谱，通过与相应缺味阴性样品和药材进行对比分析，考查指纹图中指纹峰与药味的相关性。这里主要对苷类成分指纹图谱与天麻药材的相关性进行考查。

2.1.7.1 供试品溶液的制备 天麻供试品溶液制备:按供试品溶液制备方法，取天麻药材粗粉1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10mL，称定重量，超声处理(功率:240W，频率:45Hz)1h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

阴性供试品溶液制备:取缺天麻药材的神安颗粒约1g，按上述制备方法进行制备。

2.1.7.2 色图谱的制定 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录50分钟的色谱图。分别比较各待测溶液指纹图谱，结果见图3。结果表明神安颗粒苷类成分指纹图谱s号峰来源于天麻。

图3 指纹图谱对比分析

3 讨论

3.1 神安颗粒“全指纹图谱系” 中药的“全指纹图谱系”应根据方中药物的信息、成分分析、功能主治相关药效作用等，确定中药所含有的具体各类成分，进而根据每一类成分的提取方法和仪器条件制定出相应的指纹图谱，并进一步确定中药“全指纹图谱系”中每张指纹图谱中每一个指纹峰的来源。在对神安颗粒指纹图谱的研究中，因神安颗粒成分复杂，一张指纹图谱难以反映大部分成分的信息，故进行了“全指纹图谱系”研究，建立了以天麻素为代表的苷类成分、以五味子醇甲为代表的脂溶性成分和以斯皮诺素为代表的水溶性成分的指纹图谱，主要探讨了以天麻素为代表的苷类成分指纹图谱的研究，并与天麻药材和缺天麻样品进行了相关性分析，确定了部分指纹峰的来源。

3.2 区间指纹图谱的构思 针对指纹图谱分析结果中杂质峰群存在，本文提出了“区间指纹图谱”的构建，即是建立某一区间的指纹图谱:整个指纹图谱把它分为几个区间(时间段)，在一定区间内可能杂质峰群比较集中，可不对这一区间的杂质峰群进行指纹峰的定位，而对一定区间内色谱峰均分离较好的组峰尤其是参比峰所在区间进行指纹峰的定位，从而构建起这一区间的指纹图谱。这可以很好的解决指纹图谱研究中出现的杂质峰群问题，从而为天然产物指纹图谱的建立打开了新的思路和方法，也为指纹图谱建立的可行性提供了更多的试验依据。

3.3 神安颗粒“区间指纹图谱” 在对神安颗粒指纹图谱的研究中，因神安颗粒成分复杂，故建立神安颗粒中以天麻素为代表的苷类成分指纹图谱。在研究以天麻素为代表的苷类成分指纹图谱中，优化了色谱条件。在区间0～10min内有大量的杂质峰群，而在区间10～50min内主要指纹峰分离较好，因而选择了这一区间建立了神安颗粒苷类成分的指纹图谱。

［1］Natalie Lazarow ych.Use of Fingerprinting and Marker Compounds for Identification and Standardization of BotanicalDrugs:Strategies for Applying Pharmaceutical HPLC Analysis to Herbal Products［J］.Drug Inf ormation Journal，1998，32:497 －512.

［2］Peter John Houghton.Establishing Identification Criteria for Botanicals［J］.Drug In formation Journal，1998，32:461 －469.

［3］任德权.中药指纹图谱质控技术的意义与作用［J］.中药新药与临床药理，2001，12(3):135 －140.

［4］国家食品药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知［J］.中成药，2000，22(10):671－675.

［5］黄小玲，杨春燕，袁慧文.天麻药材高效液相色谱指纹图谱研究［J］.中国药业，2011，20(2):17 －19.