去整合素Echistatin对糖尿病兔后发性白内障模型中晶状体上皮细胞间质转分化及胶原合成的影响△

陈迎迎 谭少健 梁皓 钱光霞

已有研究发现，糖尿病患者行白内障术后后囊膜混浊 (posterior capsular opacification，PCO)的发生率明显高于血糖正常者［1］，为 10.0%～57.5% ，且随着时间的推移而增加［2-3］。PCO还影响糖尿病患者眼底检查、视网膜光凝以及玻璃体手术治疗效果。目前认为PCO属于晶状体纤维化疾病，白内障术后残留的晶状体上皮细胞-间质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是 PCO形成的重要一环［4］。有研究显示整合素在出现创伤后的晶状体囊袋上有过度表达［5］，并参与了 EMT 的过程［6］，与晶状体的纤维化疾病中成纤维细胞和肌纤维母细胞过度活化、增殖有关［7］。而 α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)是 EMT 的表型标志［4］，Ⅳ型胶原是PCO中EMT产生细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重要组成部分。因此，观察整合素的抑制剂——去整合素对 α-SMA和Ⅳ型胶原表达的影响，探讨整合素在糖尿病模型中PCO形成时EMT过程中的作用机制，或许有助于糖尿病性后发性白内障的治疗。本研究建立糖尿病兔后发性白内障模型，观察去整合素Echistatin对糖尿病兔行晶状体摘出术后PCO发生的最早时间(10 d)和最显著时间(6周)［8］的干预作用，观察其对后囊膜上 α-SMA和Ⅳ型胶原表达的影响，探讨去整合素防治高血糖下PCO的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与动物 新西兰大白兔24只，雌雄不限，体质量2.4～2.8 kg，眼部检查无异常;由广西医科大学实验动物中心提供。本实验动物的饲养与使用均遵循视觉与眼科学研究学会(ARVO)关于动物使用原则的规定，并且经广西医科大学动物伦理委员会批准。去整合素 Echistatin(美国 Sigma公司)，四氧嘧啶(Sigma公司)，血糖分析仪(美国强生)，血糖试纸条(美国强生)，长效胰岛素注射液(甘精胰岛素注射液，Sanofi-Aventis Deutschland GmbH，德国)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病兔模型的建立 将新西兰大白兔用四氧嘧啶按100 mg·kg－1建立糖尿病兔模型，当血糖持续2周大于12 mmol·L－1时为建模成功。对于血糖浓度高于16 mmol·L－1者，根据血糖值给予皮下注射长效胰岛素，使其血糖控制在12～16 mmol·L－1之间。

1.2.2 糖尿病兔后发性白内障模型的建立及分组24只建模成功的糖尿病兔24眼(右眼)按随机数字表法分为对照组和 7.5 mg·L－1组、10.0 mg·L－1组，每组又随机分为10 d和6周2个时间点。每只兔右眼由同一术者行透明晶状体囊外摘出术，术毕晶状体囊袋内注药0.2 mL:对照组为高压灭菌后蒸馏水，7.5 mg·L－1组、10.0 mg·L－1组分别注射7.5 mg·L－1、10.0 mg·L－1的去整合素 Echistatin 溶液。术毕用庆大霉素地塞米松注射液结膜下注射，术后速康宁眼液和阿托品眼液滴术眼7～10 d，每天4次。夜晚涂四环素可的松眼膏，直至角膜水肿、前房渗出消失。

1.2.3 临床观察 术后10 d、6周分别行裂隙灯检查PCO情况。按Odrich等［9］对PCO的分级标准进行分级:0级为透明;1级为轻度混浊，能看清眼底或混浊面积小于1/2后囊膜面积;2级为中度混浊，能模糊看见眼底或混浊面积大于1/2后囊膜面积;3级为完全混浊，不能看见眼底。

1.2.4 荧光定量 PCR

1.2.4.1 标本处理 各组兔分别于术后10 d和6周空气栓塞法处死，立即取出术眼晶状体后囊膜速冻于－80℃冰箱，用于RT-PCR检则。

1.2.4.2 引物 引物序列由大连宝生物有限公司设计并合成，α-SMA的上游引物:5’-CCCTGAAGAACATCCAACCCTG-3’;下游引物:5’-AGCACCGCCTGAATAGCCAC-3’;Ⅳ型胶原的上游引物:5’-GGCAAGTAGATGATAAAGGCGAGA-3’;下游引物:5’-TCCCATAAAATCCATCCCAAAG-3’。内参 GAPDH 的上游引物:5’-GAATCCACTGGCGTCTTCAC-3’;下游引物:5’-CGTTGCTGACAATCTTGAGAGA-3’。使用前将引物稀释至10 μmol·L－1，－20℃保存。

1.2.4.3 总 RNA 的提取、逆转录及 RT-PCR 使用Trizol提取晶状体后囊膜总RNA，测定RNA浓度，根据总 RNA浓度进行逆转录，共20 μL。PCR反应体系为20 μL，于荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件:两步法PCR扩增，第一步:95℃ 5 min预变性;第二步扩增:95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。扩增后立即行溶解曲线分析，程序为:95℃ 5 s，65℃ 1 min，从65℃连续升温至97℃的过程中每隔0.5℃测定其吸光度值。最后，降温至40℃。采用相对定量法测定目的基因PCR产物和GAPDH PCR产物的Cp值。相对定量公式:2－△△Ct，其中△△Ct= (Cp目的基因－CpGAPDH)处理组－(Cp目的基因－CpGAPDH)未处理组。

1.3 统计学分析 所有统计均采用 SPSS 17.0统计软件进行，各组PCO分级眼数分布的数据资料以频数表示，差异比较采用秩和检验。各组α-SMA和Ⅳ型胶原 mRNA相对表达量的数据资料以表示，各组不同时间点mRNA相对表达量的总体差异比较采用方差分析，组内多重两两比较采用 LSD-t检验;同一时间点各组间比较选用LSD法单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术眼术后观察 各组兔眼术后均出现不同程度的角膜水肿及前房闪辉，术后3～5 d对照组及7.5 mg·L－1组基本恢复正常，10.0 mg·L－1组角膜水肿持续至7～10 d恢复正常。

2.2 晶状体PCO分级情况 各组兔眼晶状体囊外摘出术后10 d和6周 PCO分级情况见表1、图1。术后10 d各组PCO程度比较差异无统计学意义(P=0.090);术后6周组间差异有统计学意义(P=0.024)，Echistatin干预组 PCO级别明显低于对照组，但不同浓度组间差异无统计学意义(P=0.127)。

2.3 α-SMA mRNA表达变化 α-SMA mRNA表达变化见表2。由表2可见:不同浓度组间α-SMA mRNA表达变化差异有统计学意义(F=3.989，P=0.037);从术后10 d～6周，随着时间的延长，α-SMA mRNA 表达增加(F=46.343，P＜0.001);Echistatin作用浓度和作用时间之间无交互作用(F交互作用=3.381，P=0.057)。术后10 d，各组间 α-SMA mRNA表达差异无统计学意义(F=0.271，P=0.769);术后6 周，7.5 mg·L－1组 α-SMA mRNA 表达低于对照组及 10.0 mg·L－1组(P=0.002、0.024)，但对照组与 10.0 mg·L－1组间 α-SMA mRNA 表达差异无统计学意义(P=0.235)。与术后10 d相比，术后6周7.5 mg·L－1组 α-SMA mRNA 表达无显著提高(P=0.054)，而对照组与 10.0 mg·L－1组 α-SMA mRNA表达均明显高于术后 10 d(P＜0.001)，提示7.5 mg·L－1组对 α-SMA mRNA 表达的抑制作用较持久稳定。

表1 术后10 d及6周时各组PCO分级Table 1 PCO grades of each group at postoperative 10 days and 6 weeks (n=4)

Figure 1 PCO grades of each group at postoperative 6 weeks.A:Control group，grade 3;B:7.5 μg·mL－1 group，grade 0;C:10 μg·mL－1 group，grade 1 术后6周时各组 PCO分级。A:对照组 PCO 3级;B:7.5 mg·L－1组 PCO 0级;C:10.0 mg·L－1组 PCO 1级

表2 各组α-SMA mRNA表达变化Table 2 Expressions of α-SMA mRNA in each group (¯x± s，n=4)

2.4 Ⅳ型胶原mRNA表达变化 Ⅳ型胶原mRNA表达变化见表3。由表3可见:Echistatin干预后的Ⅳ型胶原 mRNA 表达明显下降(F=5.854，P=0.011);不同时间Ⅳ型胶原mRNA表达差异无统计学意义(F=0.909，P=0.353);Echistatin 作用浓度和作用时间之间无交互作用(F=2.868，P=0.083)。术后 10 d，Ⅳ型胶原mRNA表达各组间差异无统计学意义(P ＞0.05);术后 6 周 7.5 mg·L－1组、10.0 mg·L－1组Ⅳ型胶原 mRNA表达均低于对照组(P=0.005、0.002)。术后6周，对照组Ⅳ型胶原mRNA表达较术后 10 d 增加(P=0.025)。提示 7.5 mg·L－1和 10.0 mg·L－1Echistatin均能持久有效地抑制Ⅳ型胶原合成。

表3 各组Ⅳ型胶原mRNA表达变化Table 3 Expressions of collagen typeⅣmRNA in each group (¯x± s，n=4)

3 讨论

后发性白内障对于糖尿病患者来说除了再次降低术后视力外，还对糖尿病引起的眼后节疾病的诊断、治疗造成影响，因此积极干预糖尿病患者的后发性白内障有着重要的现实意义。储昭节等［10］实验证实高血糖条件下，体外培养人 LEC的 α-SMA、FN表达明显高于正常血糖组，说明高浓度葡萄糖可诱导LEC向间质转化。Zablocki等［11］发现在糖尿病相关基因转染21 d后，小鼠晶状体出现混浊，混浊斑块上可见α-SMA、γ-crystallin等 EMT标志的强阳性表达，而正常小鼠晶状体仍保持透明，提示即使不经过手术创伤炎症的刺激，糖尿病相关基因亦可以诱导晶状体发生EMT，进而促进晶状体混浊，由此可能造成糖尿病患者白内障术后更易出现PCO。本课题组前期研究中亦发现［8］，与正常血糖兔相比，糖尿病兔的PCO发生率较高，LEC的增殖能力较强。糖尿病兔发生PCO的最早时间(10 d)和最显著时间(6周)均较正常血糖兔(14 d、3个月)提前。

整合素是一类重要的细胞表面跨膜受体，也是ECM成分的主要受体，介导细胞与 ECM的相互作用。有研究表明整合素的正常表达是维持LEC正常表型的重要保障［7］。当晶状体受到创伤刺激时，整合素的异常分泌促进了晶状体EMT的过程，使其转分化为有收缩功能、可表达α-SMA的肌成纤维细胞以及包括Ⅳ型胶原在内的胶原合成增加，从而促进了晶状体纤维化疾病PCO的发展［12-13］。同时有研究表明，高血糖能够促进整合素β1等受体的表达增加［14］，进而诱导LEC增殖和促进上皮间质化的转变［7］。在本研究中也发现对照组糖尿病兔晶状体摘出术后后囊膜上α-SMA和Ⅳ型胶原的mRNA表达随时间延长逐渐提高。因此抑制和阻断整合素是干预高血糖条件下PCO形成的可行方法。

本研究应用的去整合素Echistatin对整合素αvβ3受体有特异性的抑制作用。多个研究显示在PCO的EMT发展过程中，整合素 αvβ3起着重要的作用。伴随着晶状体后囊膜上腱糖蛋白、玻连蛋白及纤连蛋白等ECM的异常增生，其受体整合素αv与多种 β 亚基组成的二聚体 αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6出现过表达状态，提示αv与晶状体纤维化疾病发生过程中 EMT 的过程有密切的关系［7］。Galliher等［15］发现整合素αvβ3通过调控其下游的转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)受体促进 EMT的发生，当整合素 β3缺乏时，TGF-β 无法诱导出EMT［15］。而在PCO发展过程中EMT所必需的Src激酶活化也被认为是依赖αvβ3的信号转导完成的［7］。这些均提示αvβ3在EMT过程中的关键作用。因此阻断整合素αvβ3受体是抑制EMT的有效途径。

朱玉广等［16］使用去整合素 Kistrin(整合素 αvβ3拮抗剂)可抑制TGF-β2诱导的体外人 LEC的 EMT过程。Shah等［17］研究也发现去整合素 Echistatin通过阻断整合素αvβ3和FAK的信号转导抑制了EMT的发生。本研究结果显示7.5 mg·L－1和10.0 mg·L－1去整合素Echistatin在术后远期有效抑制了糖尿病兔PCO的发生和发展。进一步探索其对EMT的影响发现，虽然 7.5 mg·L－1和 10.0 mg·L－1去整合素 Echistatin对早期(10 d)α-SMA及Ⅳ型胶原mRNA的表达均无明显干预效果，但远期抑制作用颇为显著。术后6周7.5 mg·L－1去整合素Echistatin明显抑制 α-SMA mRNA的表达，其表达与10 d无显著差异。但我们同时发现更高浓度的10.0 mg·L－1组却未出现更强的抑制作用，其术后6周α-SMA mRNA的表达量是10 d的3.6倍，抑制作用与对照组无明显差异。其原因可能是当高浓度去整合素应用于眼内时，短期内对眼内组织如角膜及虹膜等产生较明显毒性作用，破坏了术眼的血-房水屏障，且炎症介质释放、补体激活，以及一些细胞因子的释放均可刺激EMT的发生，导致α-SMA表达反而增高。而 7.5 mg·L－1和10.0 mg·L－1Echistatin 则均显示出对Ⅳ型胶原明显的抑制作用，并在术后晚期保持了较稳定的抑制效果，提示Echistatin能在较大的浓度范围内对Ⅳ型胶原合成有持久的抑制作用。

综上所述，本实验结果初步显示去整合素Echistatin可有效抑制糖尿病兔晶状体摘出术后晶状体后囊膜上α-SMA和Ⅳ型胶原的mRNA表达，减少EMT发生和胶原合成，从而抑制PCO的发生发展。

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