水蛭提取液对体外培养 RF/6A的细胞液中MMP-2、IV型胶原含量的影响△

郑燕林 刘聪慧 沙菽

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一个Zn+依赖性蛋白酶家族，产生于正常组织细胞(包括结缔组织细胞、内皮细胞、胸腺细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等)和肿瘤细胞，以前酶形式分泌，于细胞外间隙激活后发挥作用。

研究已发现MMPs与血管新生［1-3］、肿瘤细胞的侵袭及转移以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的降解过程密切相关，是降解ECM的主要成份［4-7］。前期研究发现64 g·L－1水蛭提取液对体外培养的视网膜血管内皮细胞有抑制增殖作用［8］，为进一步证明水蛭提取液对内皮细胞微环境的作用，本实验拟采用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent，ELISA)、放射免疫法检测水蛭提取液对细胞培养上清液中 MMP-2、IV型胶原(IV型胶原)表达的影响，初探水蛭提取液对新生血管生长的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 中药水蛭提取液购自成都中医药大学附属医院制剂科(批号:2007030201)，RF/6A(上海中科院细胞库)，体积分数为10%的特级胎牛血清(北京元亨公司)，1640干粉(GIBCO公司)，25 g·L－1胰蛋白酶(美国 Sigma公司)，MCD-15A 型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)，JJT-900/1300型超净工作台(北京半导体设备厂)，XDS-1型倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)，IV型胶原放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)，MMP-2 ELISA试剂盒(上海森雄公司)，GC-1200放射免疫技术器(中国科大创新股份有限公司)，550酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 水蛭提取液的制备 取水蛭粗粉31.5 g，加体积分数75%乙醇200 mL，使均匀润湿，加盖，放置2 h，装入渗滤筒中。添加体积分数75%乙醇高出药面3 cm，排除筒内空气。加盖放置48 h后放出药液，流速3 mL·min－1，并从药面不断添加体积分数75%乙醇5000 mL，渗滤液回收乙醇至无醇味，定容至50 mL，每毫升相当于0.63 g原生药，药液经60℃照射灭菌，备用。药物使用前用直径45 μm过滤器过滤。

1.2.2 细胞传代培养 细胞融合后，吸去旧的培养液，用PBS轻缓漂洗培养物1～2次，尽量洗去残余的未贴壁的细胞及杂质，弃平衡盐溶液;加入2.5 g·L－1胰蛋白酶约 2 mL，于 37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中消化2～3 min;在倒置相差显微镜下观察，发现细胞皱缩变圆，细胞间隙变大，大部分细胞脱壁时，加入体积分数10%RPMI 1640培养液2 mL终止消化;吸取培养瓶内的培养液，反复有序、轻柔吹打培养瓶壁细胞，脱壁后形成细胞悬液，室温下1000 r·min－1离心 3 min，弃上清液;按 1∶3 的比例接种于新的培养瓶中。送入培养箱内继续培养，2～3 d换液1次。空白细胞以无血清培养液培养，凝血酶组细胞以含20 U·mL－1的培养液培养，水蛭组细胞以含水蛭提取液64 g·L－1培养液培养，合药组细胞以含凝血酶20 U·mL－1水蛭提取液 64 g·L－1培养。

1.2.3 检测指标 选择生长良好的细胞，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后，用含体积分数10%RPMI1640培养液重新计数调整，以2×104mL－1浓度接种于96孔培养板。每组设18个复孔，于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育48 h，吸尽旧培养液，PBS洗涤。每孔加入 200 μL 共同培养，于作用后 2 h、6 h、12 h，各取培养液 200 μL，3000 r·min－1高速离心 10 min，使细胞、碎片沉淀，取上清，用于检测指标。用双抗体夹心ABC-ELISA法测定不同时间点培养液中MMP-2的含量(按试剂盒步骤进行操作)。用放射免疫的方法测定不同时间点培养液中Ⅳ-C的含量(按试剂盒步骤进行操作)。

1.3 统计方法 对本研究数据采用SPSS 13.0统计软件包，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验，进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-2检测结果 由表1可知，2 h、6 h时各组之间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。12 h时各组间比较，空白组、水蛭组 MMP-2的表达低于凝血酶组，组间差异均有统计学意义(均为 P＜0.05);空白组与水蛭组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05);合药组与空白组、水蛭组、凝血酶组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。

表1 不同时间点各组MMP-2含量OD值比较Table 1 Comparison of OD value of MMP-2 in different group at different time points(，n=6)

表1 不同时间点各组MMP-2含量OD值比较Table 1 Comparison of OD value of MMP-2 in different group at different time points(，n=6)

Group 2 hours 6 hours 12 hours Normal 0.147±0.006 0.148±0.004 0.137±0.006 Leech 0.151±0.006 0.135±0.003 0.136±0.007 Mixing 0.148±0.017 0.148±0.011 0.156±0.012 Thrombin 0.150±0.014 0.155±0.018 0.165±0.018

空白组12 h时 MMP-2含量低于2 h、6 h，组间差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，2 h与6 h组、2 h与12 h组间差异均无统计学意义(均为 P＞0.05)，推测 MMP-2的分泌随时间而降低。凝血酶组各时间点间差异均无统计学意义(P＞0.05)，但均数比较，呈上升趋势。水蛭组2 h时MMP-2的分泌高于6 h、12 h，差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，6 h、12 h间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，均数呈下降趋势。合药组各时间点比较，差异均无统计学意义(均为P＞0.05)，均值呈上升趋势(图1)。

Figure 1 Histogram of OD value of MMP-2 in each group 各组MMP-2 OD值比较柱状图

2.2 IV型胶原检测结果 由表2可知，在同一时间点上，不同组间IV型胶原的含量不同。正常培养状态下，2 h时空白组IV型胶原的含量高于凝血酶组、合药组，差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)，空白组与水蛭组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，凝血酶组、水蛭组、合药组间差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。6 h时水蛭组IV型胶原的含量明显高于其他3组，两两比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05)，凝血酶组、合药组、空白组间差异无统计学意义(P＞0.05)。12 h时空白组IV型胶原的含量明显高于合药组，差异有统计学意义(P＜0.05);水蛭组IV型胶原的含量明显高于凝血酶组及合药组，差异有统计学意义(P＜0.05);而凝血酶与合药组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 同一时间点各组IV型胶原含量Table 2 Type IV collagen contents in each group at same time point (ˉx±s，n=6，ρ/ng·mL－1)

空白组2 h、12 h IV型胶原的含量均较6 h高，差异均有统计学意义(均为 P ＜0.05)，2 h、12 h间差异无统计学意义(P＞0.05)。凝血酶组IV型胶原的合成呈增加趋势，12 h与2 h相比，差异有统计学意义(P＜0.05);6 h时IV型胶原的含量处于两者之间，差异均无统计学意义(均为 P＞0.05)。水蛭组IV型胶原的合成呈明显增加，6 h、12 h时IV型胶原的含量显著高于2 h时，差异均有统计学意义(均为P＜0.05);6 h、12 h之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。合药组在3个时间点上IV型胶原的含量差异无统计学意义(P＞0.05，见图2)。

Figure 2 Histogram of type IV collagen contents in each group 各组IV型胶原含量比较柱状图

3 讨论

ECM是组成间质和上皮-血管中基质的不溶性结构成份，包括各型胶原、蛋白多糖、糖蛋白和弹性蛋白等。ECM是一种活跃的动态物质，影响细胞的分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程。另外，ECM还存在一些可溶性成份，主要有与基质代谢相关的蛋白酶和与基质结合的细胞因子。

血管内皮细胞受病理性原因的刺激，向血管形成刺激物方向迁移、增殖过程中，内皮细胞周围的ECM必须有选择性地降解，控制这一活动的酶就是MMPs。MMPs主要作用是降解胶原等ECM，金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)是MMP的特异性抑制剂，MMP与TIMP的平衡维持着体内ECM合成与降解的平衡，是维持组织器官正常结构和生理功能的关键，MMP与TIMP之间平衡的破坏是新生血管产生的重要原因。

目前在眼底新生血管性疾病中，对MMPs的研究在不断深入，证明了MMPs与眼部新生血管的形成有密切关系［9-11］。血管内皮细胞能分泌多种 MMPs，眼部新生血管性疾病中研究最多的是 MMP-2、MMP-9［12-17］。本实验任意选择了其中的MMP-2作为研究点，探讨了水蛭提取液对MMP-2分泌的作用。

本研究结果显示，细胞在不同的生长环境中MMP-2分泌不同。空白组2 h即有MMP-2的分泌，12 h时各组间 MMP-2的含量出现差异，空白组、水蛭组的MMP-2表达低于凝血酶组，组间差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)，合药组与空白组、水蛭组、凝血酶组间差异均无统计学意义(均为 P＞0.05)，但合药组的 MMP-2含量的均数较凝血酶组降低，说明水蛭降低了凝血酶促进MMP-2分泌的作用;合药组均数6 h、12 h时较水蛭组高，也进一步证明了凝血酶有促进细胞分泌MMP-2的作用，与文献报道相符［18］。

从各组纵向观察，虽各时间点间无显著性差异，但由均数看，正常组细胞分泌的MMP-2随时间延长呈轻度下降趋势，12 h时明显降低。水蛭组细胞分泌的MMP-2亦呈下降状，水蛭有降低MMP-2分泌的作用。凝血酶组细胞分泌的MMP-2呈上升趋势。合药组MMP-2分泌量，与水蛭组、凝血酶组的纵向变化相比，合药组MMP-2的分泌要处于两者中间的走向趋势，推测水蛭提取液对凝血酶促MMP-2的分泌有抑制作用。

血管生成中胶原的合成与聚集起重要作用，IV型胶原有促进细胞黏附、迁移、分化、生长的作用，在肿瘤血管生成中作用很关键［19］。IV型胶原是ECM的主要成分之一。本研究结果发现，2 h时空白组IV型胶原的含量较高。6 h时、12 h时水蛭组IV型胶原的含量较高。纵观3个时间点，空白组IV型胶原的含量相对稳定，凝血酶组、水蛭组、合药组IV型胶原的合成均有增加趋势，水蛭组的增加幅度明显。

研究已证实，凝血酶具有促进MMPs分泌增加及ECM、基底膜降解的作用，控制降解的酶是MMPs［20］，但 MMPs 的成员较多，ECM、基底膜降解是多种因素共同作用的结果，如 MT1-MMP［21］、MMP-9［22］等。

本研究结果提示了64 g·L－1水蛭提取液可以降低体外培养条件下ECM中MMP-2的含量，并随作用时间的增加，有促进下降的趋势;凝血酶组随着作用时间的增加，有促进MMP-2分泌增加的趋势;64 g·L－1水蛭提取液有抵制凝血酶促进 MMP-2分泌的作用;同时64 g·L－1水蛭提取液可以促进体外培养下ECM中IV型胶原的合成，并随作用时间的持续，有促进合成增加的趋势，从而抑制了ECM的降解;凝血酶组随着作用时间的增加，有轻度促 IV型胶原的合成增加的趋势，但与空白组相比，有降低IV型胶原的合成，促进 ECM降解的作用;2 h时64 g·L－1水蛭提取液有降低凝血酶促进ECM降解的作用。由此我们提出64 g·L－1水蛭提取液促进了在体外培养条件中凝血酶诱导下细胞微环境中IV型胶原的合成，抑制了MMP-2的分泌，改变了细胞生长的微环境，对新生血管的形成有抑制作用，但其机理尚不完全清楚，有待进一步的研究。

1 Das A，M cLamore A，Song W，M cGuire PG.Retinal neovascularization is suppressed with a matrix metalloproteinase inhibitor［J］.Arch Ophthalmol，1999，117(4):498-503.

2 Adithi M，Nalini V，Kandalam M.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in retinoblastoma［J］.J Pediatr Hematol Oncol，2007，29(6):399-405.

3 Burbridge M F，Cogé F，Galizzi JP，Boutin JA，W est DC，T ucker GC.T he role of the matrix metalloproteinases during in vitro vessel formation［J］.Angiogenesis，2002，5(3):215-226.

4 Hrabec E，Naduk J，Strek M，Hrabec Z.T ype IV collagenases(M M P-2 and M M P-9)and their substrates--intracellular proteins，hormones，cytokines，chemokines and their receptors［J］.Postepy Biochem，2007，53(1):37-45.

5 Shima I，KatsudaS，UedaY，T akahashi N，Sasaki H.Expression of matrix metalloproteinases in wound healing after glaucoma filtration surgery in rabbits［J］.Ophthalmic Res，2007，39(6):315-324.

6 Fu X，Parks W C，Heinecke JW.Activation and silencing of matrix metalloproteinases［J］.Semin Cell Dev Biol，2008，19(1):2-13.

7 车绪春，陆 融，姚 智.基质金属蛋白酶在肿瘤血管生成中的作用［J］.国际肿瘤学杂志，2007，34(2):84-87.

8 郑燕林，刘聪慧，谭圣炎.水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖和细胞周期的影响［J］.眼科新进展，2010，30(5):413-417.

9 Barnett JM，M cCollum GW，Fowler JA，Duan JJ，Kay JD，Liu RQ，et al.Pharmacologic and genetic manipulation of M M P-2 and-9 affects retinal neovascularization in rodent models of OIR［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(2):907-915.

10 Sánchez M C，Barcelona PF，Luna JD，Ortiz SG，Jurez PC，Riera CM ，et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein-1(LRP-1)expression in a rat model of oxygen-induced retinal neovascularization［J］.Exp Eye Res，2006，83(6):1378-1385.

11 Kvanta A，Shen W Y，Sarman S，Sereqard S，Steen B，Rakoczy E.M atrix metalloproteinase(M M P)expression in experimental choroidal neovascularization［J］.Curr Eye Res，2000，21(3):684-690.

12 He T，Xing YQ，Zhao XH，Ai M.Interaction between iNOS and COX-2 in hypoxia-induced retinal neovascularization in mice［J］.Arch Med Res，2007，38(8):807-815.

13 Navaratna D，M cGuire PG，M enicucci G，Das A.Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes［J］.Diabetes，2007，56(9):2380-2387.

14 Hoffmann S，He S，Ehren M ，Ryan SJ，W iedemann P，Hinton DR.M M P-2 and M M P-9 secretion by rpe is stimulated by angiogenic molecules found in choroidal neovascular membranes［J］.Retina，2006，26(4):454-461.

15 Giebel SJ，M enicucci G，M cGuire PG，Das A.M atrix metalloproteinases in early diabetic retinopathy and their role in alteration of the blood-retinal barrier［J］.Lab Invest，2005，85(5):597-607.

16 Adithi M，Nalini V，Kandalam M，Krishnakumar S.Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in retinoblastoma［J］.J Pediatr Hematol Oncol，2007，29(6):399-405.

17 Yamada E，T obe T，Yamada H，Okamoto N，Zack DJ，W erb Z，et al.T IM P-1 promotes VEGF-induced neovascularization in the retina［J］.Histol Histopathol，2001，16(1):87-97.

18 石建霞，顾 健.凝血酶与肿瘤的血管新生［J］.中国实验血液学杂志，2006，14(1):197-200.

19 李玉英，钱桂生，黄桂君.血管生成抑制剂 Canstatin研究概况［J］.生物医学工程学杂志，2005，22(3):626-628.

20 Egeblad M，W erb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(3):161-174.

21 Jeong JW ，Cha HJ，Yu DY，Seiki M，Kim KW .Induction of membrane-type matrix metalloproteinase-1 stimulates angiogenic activities of bovine aortic endothelial cells［J］.Angiogenesis，1999，3(2):167-174.

22 陈陆霞，张诗武，孙保存，张丹芳，何彦津，贺忠江.M M P-2，M M P-9的表达与脉络膜黑色素瘤微血管密度及肿瘤转移的关系［J］.眼科新进展，2007，27(8):565-567.