农业院校基础生化实验方法的改进和探索——以“淀粉酶活力测定”实验为例

易晓华YI Xiao-hua

（青岛农业大学生命科学学院，青岛266109）

0 引言

基础生化实验是农业院校中为农学、园艺、植保、食品、资环、生物工程等专业开设的一门重要专业基础课，旨在提高学生的实验技能和培养学生的科研素养。“淀粉酶活力测定”实验是青岛农业大学为本科生开设的基础生化实验课的内容之一[1]，是针对生物化学理论课程中新陈代谢部分设置的实验，以便于通过实验的实践操作，让学生掌握和理解生物体内新陈代谢的本质和酶的基本特性。

该实验采用3，5二硝基水杨酸比色法（DNS法），先提取定量小麦芽（发芽3-5天）中的淀粉酶，然后用分光光度法比色测定淀粉酶活力，实验既有酶的提取，又有活力测定，活力测定时既有测定管，又有对照管，还有空白管，致使很多学生错将酶反应中的对照管直接用作比色测定时的调零空白管，重做现象时有发生，原本并不复杂的实验，因为步骤繁杂，学生常常顾此失彼，不仅不能在规定的时间内完成实验，而且严重的影响了学生的积极性和实验教学效果；此外，学生操作时，往往因取材部位不同，而测定结果迥异；学生实验报告也存在书写混乱不规范的现象。鉴于此，笔者对该实验操作步骤做了些适当的调整和改进，化繁为简，不但减少了实验误差，而且提高了实验的准确性；同时在实践中总结出学生实验操作中的注意事项，减少了学生实验出错的几率，提高了实验教学效果；明确了实验报告要求和书写格式，使学生的报告更加规范。现将结果报告如下。

1 实验的基本原理

萌发的种子中存在α-淀粉酶和β-淀粉酶两种淀粉酶，利用β-淀粉酶耐酸不耐热的特性，在高温（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性（α-淀粉酶耐热不耐酸，在pH3.6下则发生钝化），然后在不经过高温（70℃）处理下测得总酶的活力。

采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸还原生成棕红色的3-氨基-5-硝基-水杨酸，其颜色的深浅与麦芽糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。

2 实验材料、试剂和仪器

①材料：萌发3-5天的小麦，芽长1-1.5cm，根长1-3cm。②试剂：3，5-二硝基水杨酸，酒石酸甲钠，0.4mol/L氢氧化钠溶液，pH5.6柠檬酸缓冲液，麦芽糖标准液（1mg/mL）。③仪器：751分光光度计，离心机，水浴锅，离心机，天平，容量瓶，研钵，试管（25mL）。

3 原实验步骤

称取2克麦芽（全麦芽）研成匀浆后定容至50mL，离心后上清液即为酶提取液，然后分别设置反应条件，给予α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶反应。在标准曲线做好之后，另取8只15mL试管，分别取上述反应液各2mL，然后各管加入3，5-二硝基水杨酸2mL，煮沸5min后，冷却后，加蒸馏水至15mL，520mn下比色，吸光值平均后在标准曲线上查相对应的麦芽糖含量，带入公式计算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶总酶的活力。

4 改进后实验步骤

根据刘瑞征等报道[2]，发芽小麦胚端淀粉酶活力比后端淀粉酶活力高，故改进后实验选择称取2克去根的麦芽，研成匀浆后定容至50mL，离心后上清液即为酶提取液，取8只25mL试管，在设置的反应条件下反应之后，直接向各管加入3，5-二硝基水杨酸2mL，煮沸5min后，冷却后，加蒸馏水至25mL，520mn下比色，吸光值平均后在标准曲线上查相对应的麦芽糖含量，带入公式计算，求得α-淀粉酶和（α+β）淀粉酶总酶的活力。

5 实验报告的规范

改进前学生写实验报告，没有统一的要求和格式，改进后我们统一了要求，规范了学生实验报告的书写，学生在写报告时，便于理清思路，教师批改也更方便明了。

6 效果评价

实验中，小麦发芽种子的研磨、酶提取液的转移定容、离心等实验操作均会损失部分提取液而带来实验误差。改进前，用量筒测量提取液体积误差较大，在将提取液稀释10倍时又放大了误差，这些都会影响到最后实验数据和实验结果；改进后，将量筒测量体积和稀释两步骤合并为用容量瓶定容一个步骤，而且用容量瓶定容体积比量筒更精确；原本要用16只15mL试管分三步进行操作，改进后只需用8只25mL试管一次操作，避免了反应液转移过程中带来的误差，因此，改进后的实验既简化了实验操作，缩短了实验时间又减少了实验误差，提高了实验准确性；另外，对学生的实验报告给出了明确的要求和统一的规范格式，既能够帮助学生清晰实验设计思路，更好地理解实验过程，便于书写，又方便了教师批改实验报告。

7 实验中的注意事项

①严格控制温度。取样前，提前把水浴锅的温度调整到所需温度；底物淀粉液、提取液、水杨酸需要40℃预热保温，以确保各试管反应液温度一致，减小误差。

②严格控制时间。酶反应时，先加底物溶液，后加酶提取液，且各管添加试剂时间和顺序要一致，以避免加样先与后的时间差异对实验结果的影响；要严格把握反应时间5min，加入NaOH终止反应要迅速，以保证反应时间的一致性；四支测定管及空白管不要混淆。

③操作要迅速、准确。研磨样品速度要快，转移样品要完全，以避免样品损失带来的误差；70℃水浴后要在冰浴条件下迅速冷却，避免β-淀粉酶恢复活性而给测定带来误差。移液管移液要准确；比色之前，一定要摇匀试管中的溶液，且要避免比色皿的差异带来的误差。

[1]高玲.朱新产等主编.基础生物化学实验教程[M].科学出版社，2012.6.

[2]刘瑞征，郑慧芬.发芽小麦籽粒不同部位的α——淀粉酶活力[J].粮食储藏，1984，03：12-14.

[3]林钻辉，周艳华.农业院校大学生创新思维培养研究[J].中国城市经济，2011（24）.