高迁移率族蛋白B1对大鼠局灶脑缺血/再灌注后大脑皮质梗死周围区神经干细胞增殖的影响*

李 满， 罗 勇， 李 圆， 孙 麟

脑缺血/再灌注损伤后，脑内会出现神经干细胞的自发增殖。既往研究证实，神经干细胞的自发增殖可发生在海马齿状回颗粒细胞下层、侧脑室室管膜下区和大脑皮质梗死周围区，并于7～10 d达增殖的高峰［1-3］。然而脑缺血/再灌注损伤后诱导神经干细胞自发增殖的内在原因一直未能明确。已知脑缺血/再灌注损伤可刺激星形胶质细胞和小胶质细胞活化并释放炎症因子高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)参与后期的炎症反应［4］。但近期研究发现，脑缺血后HMGB1的释放有利于血管内皮细胞的增殖，并促进血管再生［5］。在斑马鱼脑发育的过程中，HMGB1可促进神经前体细胞的增殖和前脑的形成［6］，而在脑出血后，HMGB1可以促进血肿周围神经干细胞的增殖和血管再生［7］。那么脑缺血/再灌注后HMGB1在受损局部的释放是否也参与了促进脑缺血后神经干细胞自发增殖，目前尚未见相关报道。本研究通过制作大鼠局灶脑缺血/再灌注模型，应用RNA干扰技术抑制脑内HMGB1蛋白表达，采用5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU)体内标记的方法，检测神经干细胞增殖高峰期再灌注7 d时大脑皮质梗死周围区BrdU和神经巢蛋白(nestin)双标记阳性细胞，判断局灶脑缺血/再灌注损伤后HMGB1蛋白表达是否有促进大脑皮质梗死周围区神经干细胞增殖的作用。

材料和方法

1 动物与分组

清洁级成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(渝)2012-0001。将大鼠随机分为假手术组、局灶脑缺血/再灌注模型组(模型组)、局灶脑缺血/再灌注+HMGB1 shRNA干扰组(RNA干扰组)和局灶脑缺血/再灌注+阴性对照shRNA干扰组(阴性干扰组)，每组12只。

2 主要试剂

BrdU购自 Sigma;兔抗大鼠 HMGB1购自 Abcam;小鼠抗大鼠胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)购自CST;兔抗大鼠巢蛋白(nestin)购自武汉三鹰生物技术有限公司;小鼠抗BrdU购自Abcam;山羊抗小鼠Alexa Flour 647Ⅱ抗购自碧云天生物制剂公司;山羊抗兔TRITCⅡ抗、β-actin和辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠Ⅱ抗均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;携带HMGB1 shRNA和阴性对照shRNA的慢病毒载体由上海吉凯基因股份有限公司合成;Western blotting相关试剂购自碧云天生物制剂公司。

3 主要方法

3.1 大鼠局灶脑缺血/再灌注模型的制备 根据Longa等［8］的经验，采用改良线栓法制备右侧大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型。大鼠经3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.1 mL/kg)后，仰卧位固定于操作台上，备皮、消毒;经颈部正中切口依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉颅外段;断离颈内、外动脉分支及交通支，距颈外动脉分叉约0.5 cm处灼烧断离颈外动脉，在残端做一环形切口;取一长35 mm、直径为0.23 mm的尼龙钓丝，在一端约5 mm长度上均匀涂一层聚氨酯，使其直径达0.25～0.26 mm左右，晾干后备用;将线栓由颈外动脉经切口向颈内动脉颅内方向插入17～20 mm，遇阻力表明线栓头端已通过大脑中动脉起始部，实现右侧大脑中动脉缺血;清理手术野，全层缝合皮肤。缺血1 h后拔回线栓至颈外动脉残端，实现再灌注。假手术组仅将线栓插入颈内动脉而不栓塞大脑中动脉。大鼠清醒后行神经功能学评分，参照Longa 5分制评分标准，评分2～3分的大鼠为造模成功，被用于实验。术中出血较多、出现呼吸困难、取脑时发现蛛网膜下腔出血及提前死亡者剔除，并补足相应只数。

3.2 慢病毒介导的脑内RNA干扰 携带HMGB1 shRNA的慢病毒序列如下:5′-GATCCCGAAGCACCCGGATGCTTCTTTCAAGAGAAGAAGCATCCGGGTGCTTCTTTTTTGGAAA-3′［3］。阴性对照 shRNA 序列对目前已知的mRNA无任何干扰作用(序列由上海吉凯基因股份有限公司提供)。再灌注2 d后，分别将RNA干扰组和阴性干扰组SD大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，置于立体定位仪(Stoslting)上，见图1。将携带HMGB1 shRNA和阴性对照shRNA的慢病毒分别注射于RNA干扰组和阴性干扰组大鼠右侧侧脑室。前囟被定为立体定位原点，前囟向后1.5 mm，向右旁开1.0 mm，深度为颅骨下3.5 mm。注射速度为0.5 μL/min，注射总体积为每只 6 μL，病毒滴度为2×1012TU/L。注射后局部留针5 min后拔针。再灌注7 d后，按照Hayakawa等［5］的方法，采用免疫荧光双标记HMGB1/GFAP和免疫印迹的方法检测RNA干扰的结果。

3.3 BrdU标记 采用腹腔注射BrdU的方法对再灌注后脑内神经干细胞进行标记。于再灌注5 d开始给予BrdU(50 mg/kg)，腹腔注射每天2次，连续2 d，见图1。行4%多聚甲醛灌流后，取大鼠(n=6)脑组织按10 μm厚度经行冠状位切片后保存于-80℃。

Figure 1.The time points of lentivirus injection and BrdU injection in focal cerebral ischemia/reperfusion rats.图1 大鼠局灶脑缺血/再灌注模型注射慢病毒及BrdU时间示意图

3.4 组织免疫荧光双标记染色 组织切片放于1%Triton X-100 PBS液中，37℃通透30 min，在pH 6.0的枸橼酸缓冲液中微波修复20 min，自然冷却至室温;BrdU染色需继续进行DNA变性，用2 mol/L HCl 37℃孵育30 min，然后用pH 8.5的硼酸钠溶液冲洗10 min。PBS液冲洗15 min。置于5%山羊血清中37℃封闭1 h。进行免疫双标，分别加Ⅰ抗nestin(1∶50)/BrdU(1∶20)和 GFAP(1∶300)/HMGB1(1∶100)4℃过夜。PBS冲洗后，加Ⅱ抗山羊抗兔TRITC(1∶50)和山羊抗小鼠 Alexa Flour 647(1∶200)37℃孵育2 h。抗淬灭封片剂封片。用配备Fluoview FVX共聚焦扫描头(Leica)的Olympus IX70倒置显微镜(Olympus)采集图像。每组6只大鼠，每只大鼠取非连续的3张切片，每张切片选取2个视野计数细胞。

3.5 Western blotting 每组6只大鼠用于Westren blotting检测。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后断头取脑，取梗死灶周围的大脑皮质放入匀浆器，按每20 mg组织加150 μL RIPA裂解液(含PMSF)的比例，在冰浴条件下加入RIPA裂解液，冰浴裂解30 min，12 000×g离心15 min，取上清液;用BCA蛋白定量法检测所提蛋白浓度。配制10%SDS-PAGE凝胶，蛋白上样量45 μg，电泳分离蛋白条带，电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉37℃封闭90 min，加HMGB1Ⅰ 抗(1∶1 000)，内参照选用 β-actin(1∶1 000)，4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠Ⅱ 抗(1∶5 000)，37℃孵育2 h后用ECL发光液显像。利用Bio-Rad apparatus显影仪显影，Quantity One 4.6.2软件分析图像。

4 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示。各组比较采用方差分析;若各组方差齐，组间两两比较采用Bonferroni检验;若各组方差不齐，组间两两比较采用Tamhane检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 脑缺血/再灌注7 d后大鼠大脑皮质梗死周围区内HMGB1蛋白的表达

采用免疫荧光双标记GFAP(星形胶质细胞标记物，蓝色)和HMGB1(红色)的表达后显示:假手术组内可见HMGB1蛋白和GFAP阳性细胞均散在分布于脑组织中，且仅有少量HMGB1的表达与GFAP阳性细胞相重叠;与假手术组比较，模型组HMGB1蛋白在梗死周围区表达增多，同时伴有GFAP阳性细胞数明显增加，且表达HMGB1的GFAP阳性细胞明显增多;而与模型组比较，RNA干扰组HMGB1蛋白表达明显被抑制;而阴性干扰组与模型组比较，HMGB1蛋白表达及GFAP阳性细胞均无明显差别，见图2A。提示再灌注7 d后梗死周围区HMGB1蛋白的表达增多，并伴有星形胶质细胞的增多;RNA干扰可以有效抑制HMGB1的表达和星形胶质细胞的局部增殖。

Western blotting检测皮质梗死周围区HMGB1表达结果显示:与假手术组比较，模型组和阴性干扰组HMGB1蛋白表达明显升高(P＜0.05);与模型组比较，RNA干扰组 HMGB1蛋白的表达明显降低(P＜0.05)。这提示再灌注7 d后HMGB1蛋白在大脑皮质梗死周围区的表达明显增多，RNA干扰可以有效抑制HMGB1蛋白表达，见图2B。

2 BrdU/nestin双标大脑皮质梗死周围区神经干细胞

免疫荧光双标记BrdU/nestin结果显示:假手术组大脑皮质内几乎没有被标记的阳性细胞;与假手术组相比，模型组大脑皮质梗死周围区可见大量BrdU/nestin阳性细胞(P＜0.05);而RNA干扰组大脑皮质内的BrdU/nestin阳性细胞明显减少(P＜0.05);阴性干扰组的BrdU/nestin阳性细胞与模型组无明显差别(P＞0.05)。提示模型组大脑皮质梗死区周围有大量神经干细胞增殖，而RNA干扰组当大脑皮质内HMGB1蛋白表达被抑制时神经干细胞的增殖能力也明显减弱，见图3。

Figure 2.HMGB1 expression in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.A:double-immunofluorescence labeling with HMGB1(red)and GFAP(blue)in the peri-infarction cortex;B:Western blotting showed the HMGB1 protein expression in the peri-infarction cortex.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.图2 再灌注7 d后HMGB1在大脑皮质梗死周围区的表达

Figure 3.BrdU(blue)/nestin(red)positive cells in peri-infarction cortex 7 d after reperfusion.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.图3 再灌注7 d后大脑皮质梗死周围区的BrdU/nestin阳性细胞表达

讨 论

脑缺血/再灌注损伤后，海马颗粒细胞下层、侧脑室周带及脑梗塞灶的周围都会出现不同程度的内源性神经干细胞增殖，这些增殖的神经干细胞可以迁移到梗死区，并分化为神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞等，参与组织结构重建和神经功能的修复［1-3］。但目前关于脑缺血/再灌注损伤后导致神经干细胞自发增殖的内在原因尚未明确。既往通过体外培养星形胶质细胞模拟脑缺血/再灌注发现，经过氧糖剥夺/复氧复糖处理后的星形胶质细胞可以增殖、活化并向有坏死细胞的部位聚集［9］。而脑损伤后神经干细胞也被激活，并迁移到有星形胶质细胞活化的损伤区［10］。因此脑缺血/再灌注后星形胶质细胞在受损区的活化和聚集可能对神经干细胞的增殖具有促进作用。但既往仅通过体外实验证实离体星形胶质细胞有向坏死细胞局部聚集的现象［9］，而无在体实验的研究。本实验通过免疫荧光标记星形胶质细胞标记物GFAP观察到再灌注7 d时大脑皮质梗死周围区星形胶质细胞明显增多，表明该部位有星形胶质细胞聚集，该结果与既往离体实验结果一致，进一步通过在体实验证实脑缺血/再灌注后星形胶质细胞在皮质梗死周围区聚集的现象。

既往的研究结果证实，脑缺血/再灌注后HMGB1在受损部位表达呈现一个先降低后升高的动态变化过程。既往通过对大鼠局灶脑缺血/再灌注模型的研究发现，再灌注1 d时HMGB1的表达明显下降，之后逐渐升高，至4 d时接近正常水平，之后逐渐高于正常水平，并持续数天至数周［3-4］。通过细胞类型的定位研究发现再灌注2 d开始，HMGB1就主要由星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞分泌［11］。本实验通过Western blotting检测证实，再灌注7 d HMGB1蛋白在大脑皮质梗死周围区的表达明显高于假手术组;结合免疫荧光双标检测发现，假手术组HMGB1蛋白主要表达于星形胶质细胞以外的其它类型的细胞，而模型组HMGB1蛋白则主要表达于星形胶质细胞，该结果中HMGB1表达的时间点变化规律及表达部位与既往的研究结果相符［4-5，11］。

HMGB1在脑缺血/再灌注后的释放不仅有加重损伤的作用，同时还有促进修复的作用。已有的研究主要关注于脑缺血/再灌注损伤后HMGB1对脑组织的损伤作用，并有研究证实HMGB1的释放可以促进神经元凋亡［12］、脑梗区的炎症反应［13］及对血脑屏障的损伤［14］。但最近的研究发现HMGB1在脑缺血损伤后有促进组织修复的作用，Hayakawa等［5］通过离体实验和在体实验均证实星形胶质细胞释放HMGB1可以促进血管内皮祖细胞的增殖，并且推断HMGB1的释放可以促进神经血管单元的重建和脑梗后神经功能的恢复。Meneghini等［15］通过体外实验证实HMGB1通过与神经干细胞表面的晚期糖基化终末产物受体结合可以促进神经干细胞增殖。Lei等［7］通过使用胶原酶诱导脑出血模型的研究发现，HMGB1可以促进血肿周围神经干细胞的增殖和血管再生。但目前尚未见HMGB1在脑缺血/再灌注损伤后促进神经干细胞增殖的报道。本实验中，我们通过选取脑缺血后神经干细胞增殖的高峰期再灌注7 d作为检测时点［1-3］，通过使用RNA干扰技术抑制皮质内HMGB1表达发现，皮质梗死周围区神经干细胞的增殖受到抑制，说明脑缺血再灌注损伤后HMGB1在脑内的表达有促进损伤部位神经干细胞的增殖作用。结合既往的研究结果［4］，我们进一步推断局灶脑缺血/再灌注损伤后HMGB1在脑梗周围区表达可能通过促进血管再生和神经再生共同促进脑组织结构重建和神经功能恢复。但局部增殖的神经干细胞是否可以在后期继续向神经元分化，并与周围的神经进一步形成突触连接尚有待进一步研究。

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