反相高效液相色谱法同时测定皮肤墨水中间苯二酚和苯酚含量＊

王晓青，刘皈阳，马建丽，吴海伟，贾燕花，徐超斗

(1．中国人民解放军总医院第一附属医院药剂药理科，北京 100048;2．中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100071)

皮肤墨水是《中国医院制剂规范》中收载的品种，临床用于皮肤划线，指示病灶范围，便于治疗[1]。目前，该品种的质量标准尚未建立含量测定项，与制剂的质量控制要求不符。为了更好地控制制剂质量，保障临床用药安全，笔者建立了同时测定该制剂中主要成分间苯二酚和苯酚含量的反相高效液相色谱(RP－HPLC)法，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Mettler AE240型电子天平(美国梅特勒－托力多公司)。间苯二酚对照品(批号为100389－201202，含量为100．0%)、苯酚对照品(批号为100509－201203，含量为100．0%)均购自中国食品药品检定研究院;皮肤墨水(长海医院1批，批号为130628;解放军总医院第一附属医院2批，批号为131106，131111);甲醇(色谱纯，Fisher公司);水为三蒸水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Agilent zorbax SB －C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(40∶60);流速:1．0 mL/min;检测波长:270 nm;进样量:10 μL;柱温:室温。

2．2 溶液制备

精密称取间苯二酚对照品36．2 mg、苯酚对照品17．1 mg，分别置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得含间苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL的对照品贮备液;再分别精密量取上述贮备液各2．5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制得每 1 mL 含间苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg 的混合对照品溶液。精密量取皮肤墨水样品0．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得供试品贮备液;精密量取供试品贮备液2．5 mL，置50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按样品处方及配制工艺，制备不含苯酚、间苯二酚的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验:分别取2．2项下3种溶液，按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图。结果见图1。可见，供试品溶液与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应的色谱峰，且供试品各组分峰的理论板数均在5 000以上，分离度大于1．5，处方中其他组分对间苯二酚和苯酚的测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密量取含间苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的对照品贮备液 1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0 mL 置50 mL容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，得不同质量浓度的混合对照品溶液。按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。以质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程，间苯二酚为Y1=7．579 X1+1．789 5(r=0．999 8)，苯酚为 Y2=8．605 X1+1．476 7(r=0．999 9)。结果表明，间苯二酚和苯酚质量浓度分别在 21．6～57．6 和 10．3 ～27．4 μg/mL 范围内与各自峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取每 1 mL 含间苯二酚 36．2 μg、苯酚 17．1 μg的混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次。结果间苯二酚和苯酚的 RSD分别为0．07%和0．10%(n=6)，表明进样精密度良好。

重复性试验:取同一批样品(批号为131106)5份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别进样测定，记录色谱图。结果间苯二酚和苯酚的含量分别为标示量的100．41%和100．27%，RSD 分别为 0．60% 和 0．50%(n=5)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，按拟订色谱条件分别于0，2，4，8，12，18，24 h 时进样测定，记录色谱图。结果间苯二酚和苯酚峰面积的 RSD分别为0．38%和0．35%(n=7)，表明间苯二酚、苯酚在24 h内稳定性良好。

加样回收试验:精密量取9份已知含量的样品溶液(批号为131106)，依法制备供试品贮备液，取供试品贮备液各2．5 mL，置100 mL容量瓶中，再分别精密加入含间苯二酚724 μg/mL、苯酚342 μg/mL 的对照品溶液 1．5，2．5，3．5 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 间苯二酚及苯酚回收率试验结果(n=9)

2．4 样品含量测定

取3批样品，按2．2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算间苯二酚和苯酚含量。结果见表2。

3 讨论

间苯二酚、苯酚结构相似，紫外吸收特性相近，故可采用HPLC法同时测定两者的含量。取间苯二酚、苯酚对照品溶液在220～400 nm波长范围内进行光谱扫描，间苯二酚结果为275 nm，苯酚为271 nm，参考文献[2－4]，选择270 nm作为检测波长。

试验中比较了在甲醇和水在不同比例的条件下，各组分的峰形和分离情况，最后确定采用甲醇－水(40∶60)为流动相。在此流动相条件下，各组分的峰形及分离度均理想，未见其他组分干扰。

在确定含量检测方法后，又对方法的耐用性进行了考察。改变流速(±0．2 mL/min)、流动相比例(±2%)，更换色谱柱(Eclipse XDB －C18柱、Eclipse plus－C18柱)，对样品含量测定的影响均较小，RSD均小于2%，表明方法耐用性良好。方法学考察结果表明，所建立的含量测定方法操作简便、快速、准确、重复性好，可用于控制该制剂的质量。

表2 样品含量测定结果(n=3)

[1]中华人民共和国卫生部药政局．中国医院制剂规范(西药制剂第二版)[M]．北京:中国医药科技出版社，1995:17．

[2]范 菲，刘鹏鸣，李锋武，等．HPLC法同时测定复方水杨酸溶液中四组分的含量[J]．药物分析杂志，2011，31(11):2 185－2 187．

[3]周蓓瀛，李 楠，张钢平，等．高效液相色谱法测定水杨酸醇溶液中水杨酸含量[J]．中国药业，2009，18(16):38－39．

[4]崔 丽．RP－HPLC法同时测定复方间苯二酚洗剂中间苯二酚和苯酚的含量[J]．中国药房，2011，22(21):2 000 －2 001．