CyclinD1和k-ras在宫颈癌中的表达及意义

刘惠琴 张志杰

(包头市中心医院妇产科，014040)

CyclinD1和k-ras在宫颈癌中的表达及意义

刘惠琴 张志杰

(包头市中心医院妇产科，014040)

目的 通过检测CyclinD1和k-ras在宫颈癌组织(实验组)，正常宫颈组织(对照组)，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ中表达水平的差异，探讨它们在宫颈癌疾病发生发展中所起的作用和可能的分子机制，为宫颈癌的病因学研究提供理论依据。方法 采用免疫组织化学方法检测宫颈癌患者15例，正常宫颈组织20例，CINⅠ 18例，CINⅡ 12例，CINⅢ 20例中CyclinD1和k-ras的表达情况，分析CyclinD1和k-ras在宫颈癌疾病发生、发展过程中的相互关系。结果 CyclinD1和k-ras与正常组织比较，在宫颈癌组织中表达明显增高，随着临床分期的增加，蛋白表达增强差异有统计学意义(P＜0.05)；k-ras蛋白、CyclinD1蛋白与年龄、宫颈癌组织分型中其表达差异无统计学意义(P＞0.05)；而在分化程度和淋巴转移方面差异有统计学意义(P＜0.05)；且在低分化组为66.7%和59.3%，在高、中分化组为23.7%和28.9%；有淋巴结转移组为54.8%和63.0%，且CyclinD1和k-ras表达明显呈正相关。结论 ①k-ras、CyclinD1蛋白的高表达与宫颈癌的发生密切相关，各种蛋白共同发挥了协同作用。②在宫颈癌疾病中CyclinD1和k-ras的表达强度增强，且二者表达明显相关。

CyclinD1；k-ras；宫颈癌

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，全世界每年约有50万妇女患病，仅次于乳腺癌，是引起女性癌症死亡的重要疾病之一，近年来宫颈癌的发病率有年轻化的趋势，因此妇科肿瘤的准确诊断和预后的判断是一个急需解决的问题[1]。宫颈癌的发生、发展及浸润、转移的过程非常复杂，多种基因的调控参与了整个过程。细胞周期和癌变不是独立存在的，细胞周期的失调是细胞过度增殖而致癌变产生的重要原因[2]。Ras信号传导通路与人类绝大多数肿瘤的发生、发展过程密切相关，该通路中的任何组分发生突变都会影响肿瘤细胞增殖、分化及凋亡。目前研究表明在许多恶性肿瘤组织中均发现Ras通路的异常激活。在黑素瘤、结肠癌、卵巢癌中等多种肿瘤中也发现了Ras的改变，Ras基因具有抑制肿瘤的功能[3]。CyclinD1是主要的G1期正调节因子，促进细胞G1-S期时相的转换，被认为是原癌基因[4]过度表达的CyclinD1蛋白促进G/S期的转换，从而加速肿瘤的发生进程[5]。因此，对Ras信号传导通路的研究，不仅对认识肿瘤的发生发展及预防有重要意义，而且还可以通过干扰该通路的过度激活而达到在基因水平上治疗肿瘤的目的。因此，研究者采用免疫组化技术检测了不同病理类型、不同临床分期的宫颈癌患者组织中k-ras和CyclinD1蛋白的表达情况，以探讨其与宫颈癌的关系及相关的临床意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象和临床资料

1.1.1 宫颈癌(实验)组 选取内蒙古包头市中心医院妇产科2009—2011年经病理学检查诊断为宫颈癌的组织标本15例，所有患者临床资料完整，术前均未行放、化疗。

1.1.2 CIN(实验)组 选取内蒙古包头市中心医院妇产科2009—2011年经病理学检查诊断为CINⅠ的组织标本20例，CINⅡ的组织标本18例，CINⅢ的组织标本12例，所有患者临床资料完整，术前均未行放、化疗。

1.1.3 正常宫颈(对照)组 选取经病理学检查确诊为正常宫颈的组织标本20例，所有患者临床资料完整。

1.2 主要试剂 k-ras和CyclinD1蛋白抗体购自美国Santa Cruz公司，即用型SP免疫组化超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物公司。

1.3 免疫组化检测 标本置于4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋组织，常温保存备用。4 μm石蜡切片常规脱蜡后，分别用于常规HE染色和免疫组化染色，免疫组化染色切片于3%过氧化氢甲醇液中室温浸泡10～15 min阻断内源性过氧化酶的活性，柠檬酸钠缓冲溶液中高压锅加热2 min进行抗原修复，1%小牛血清白蛋白室温封闭30 min，加入一抗k-ras或CyclinD1蛋白抗体，抗体稀释比例均为1∶100，置于湿盒中4℃过夜，PBS冲洗滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温继续孵育30 min，PBS冲洗后DAB显色，洗涤，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。k-ras蛋白细胞阳性结果为细胞核和(或)胞浆的黄色或棕黄色染色颗粒；CyclinD1蛋白以细胞核内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性表达细胞；阴性表达细胞呈蓝紫色。阳性标准：在高倍镜下随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，阳性细胞数＜10%为阴性表达，＞10%为阳性表达。

1.4 统计分析 运用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析，处理数据，计数资料采用χ2检验，检验水准α＝0.05。相关性分析采用Pearson。

2 结果

2.1 k-ras蛋白和CyclinD1蛋白免疫组化在宫颈癌组织中的表达情况 k-ras蛋白细胞阳性结果为细胞核和(或)胞浆的黄色或棕黄色染色颗粒；CyclinD1蛋白以细胞核内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性表达细胞；阴性表达细胞呈蓝紫色(图1)。

2.2 k-ras蛋白在不同临床分期的表达情况比较 k-ras蛋白定位于细胞核，与正常组织比较，k-ras蛋白在宫颈癌组织中表达明显增高(P＜0.05)。随着临床分期的增加k-ras蛋白则随着宫颈癌临床分期的增加阳性率显著升高(P＜0.05，表1)。

2.3 CyclinD1蛋白在不同期别的表达情况比较 CyclinD1蛋白定位于细胞核，与正常组织比较，CyclinD1蛋白在宫颈癌组织中表达明显增高(P＜0.01)。随着临床分期的增加CyclinD1蛋白则随着宫颈癌临床分期的增加阳性率显著性升高(P＜0.01，表2)。

2.4 CyclinD1蛋白在宫颈癌中的表达与临床病理特征的关系 在宫颈癌中，CyclinD1的阳性表达率在年龄、病理类型之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在组织学分型、淋巴结转移与否之间比较差异有统计学意义(P＜0.05，表3)。

图1 k-ras蛋白和CyclinD1蛋白免疫组化在宫颈癌组织中的表达

表1 k-ras蛋白在不同期别的表达情况比较

表2 CyclinD1蛋白在不同期别的表达情况比较

表3 CyclinD1蛋白在宫颈癌中的表达

2.5 k-ras蛋白在宫颈癌中的表达与临床病理特征的关系在宫颈癌中，k-ras的阳性表达率在年龄、病理类型之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)；在组织学分化程度、是否有淋巴结转移之间比较差异有统计学意义(P＜0.05，表4)。2.6 CyclinD1蛋白与k-ras蛋白相关性研究 在36例卵巢上皮癌中，CyclinD1的表达与k-ras呈正相关(r＝0.52，P＜0.00，表5)。

表4 k-ras蛋白在宫颈癌中的表达

表5 CyclinD1蛋白与k-ras蛋白相关性

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个逐步的多阶段过程，主要与癌基因的激活与抑癌基因的失活及机体免疫调节机制失衡等病理改变有关，引起细胞异常改变，导致组织癌变[6]。近年来有关信号传导通路与肿瘤发生的相关性研究已成为新的研究方向，目前对Ras/Raf/MAPK信号通路及其下游靶基因CyclinD1在肿瘤研究很多，像在瘢痕组织中研究多见，认为Ras/Raf/MAPK信号通路及其下游靶基因CyclinD1的异常表达或基因突变，与多种肿瘤的发生、发展密切相关[7]。Ras基因是一种癌基因，激活后的Ras基因主要是通过Ras/Raf/MAPK和PI3K/AKT两条通路介导肿瘤的发生[8]，Ras基因激活后可以激活其下游的MAPK信号通路而引起MAPK酶级联放大作用，使信号向下传递。在Ras/Raf/MAPK及其下游靶基因CyclinD1信号传递过程中，CyclinD1是信号通路上的重要靶基因。研究证实Ras信号通路在肿瘤的发病中以及在控制细胞生长和分化中起重要作用[9]。有研究报道Ras癌基因可以通过上调CyclinD1的表达加速细胞周期的进程[10]，提示Ras与CyclinD1之间有一定的相关性。激活的Ras信号通路使CyclinD1积聚，导致细胞进入静息状态[11]。CyclinD1是细胞周期的正调节因子，与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4/6)结合后，促使细胞从G1期顺利进入S期，使细胞发生分裂与增殖，因此CyclinD1蛋白的过度表达会使增殖周期不断进行，导致肿瘤的发生。国内外的研究已发现，CyclinD1在多种肿瘤中表达明显增高[12]。

3.1 k-ras蛋白与CyclinD1蛋白在不同组别的表达情况分析 本研究发现，k-ras蛋白与CyclinD1蛋白和正常组织比较，在宫颈癌组织中表达明显增高。随着临床分期的增加，蛋白则随着宫颈癌临床分期的增加阳性率显著升高。这与郭艳萍等[12]有关CyclinD1蛋白的研究结论一致，与胡成久等[13]对于皮肤瘢痕癌中关于k-ras蛋白研究结论一致，说明CyclinD1蛋白、k-ras蛋白的表达与宫颈癌的发生有关，并可以作为判断宫颈癌临床进展的指标。

3.2 k-ras蛋白与CyclinD1蛋白在宫颈癌中的表达与临床病理特征的关系 在对年龄组和宫颈癌组织分型中发现，k-ras蛋白与CyclinD1蛋白表达没有差别，而在分化程度和淋巴转移方面有差异，这与汪鑫和白冬雨等[14-15]报道关于k-ras基因表达与那些因素相关的结论部分一致。k-ras蛋白在宫颈癌的不同时期表达均明显高于正常，并随分化程度的增加、淋巴结转移而升高，说明k-ras作为癌基因启动基因，其表达高可以激活CyclinD1表达，促进宫颈癌组织癌的发生、发展。本研究中k-ras高表达者大部分为组织学分化低、转移率发生高的患者，提示k-ras蛋白和基因的检测可以作为宫颈癌严重程度参考指标之一。CyclinD1在宫颈癌的不同时期表达均明显高于正常，并随分化程度的增加、淋巴结转移而升高，这与郭艳萍等[12]研究相似，说明CyclinD1作为癌基因在宫颈癌组织的发生、发展中起重要作用。本研究中CyclinD1高表达者大部分(50%以上)为组织学分化低、转移率发生高的患者，提示CyclinD1蛋白可作为预测宫颈癌预后的参考指标之一。

3.3 CyclinD1蛋白与k-ras蛋白相关性 本研究发现CyclinD1蛋白与k-ras蛋白呈正相关，有关此研究报道较少，但是本研究证实了宫颈癌发生时通过k-ras激活Ras/Raf/MAPK通路及其下游靶基因CyclinD1信号传递而实现的，所以其表达具有相关性。

综上所述，肿瘤的发生是各相关基因相互作用的结果，而引起细胞增殖周期紊乱并导致细胞的无调控增殖。Ras/Raf/MAPK→CyclinD1信号传导通路上的靶基因Ras、MAPK、CyclinD1三者的关系密切，Ras蛋白的过度表达是开启此信号通路的钥匙，而MAPK蛋白的表达则把信号从细胞外转到细胞内，最终信号通路上的所有信号激活CyclinD1，CyclinD1的异常表达使细胞的增殖失控，导致肿瘤的发生[16]。

[1]Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J]. CA Cancer J Clin，2010，60(5)：277.

[2]Anderson MC.Invasive carcinoma of the cervix following local destructive treatmentforcervicalintraepithelialneoplasia[J]. Br J Obstet Gynecol，1993，100(7)：657-663.

[3]McCubreyJA，Steelman LS，ChappellWH，etal.Rolesof the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth，malignant transformation and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta，2007，1773(8)：1263-1284.

[4]Chang ZG，Wei JM，Qin CF，et al.Receptor inhibits epithelial mesenchymal transition in human pancreatic cancer PANC-1 cells[J].Dig Dis Sci，2012，57(5)：1181-1189.

[5]GaoP，Zhou GY，Liu Y，etal.Alteralion ofcyclinD1 in gastric carcinoma and its clincopathologic significance[J].World J Gastrornterol，2004，10(20)：2936-2939.

[6]张晓金，归绥琪.宫颈癌发病机制的研究进展[J].中国妇幼健康研究，2008，19(1)：56-59.

[7]赵萌，刘月平，刘世正，等.食管鳞癌中ERK及其活化形式蛋白的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2011，27(11)：1173-1176.

[8]Mccubrey JA，Steelman LS，ChappellWH，etal.Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth malignant transformationand drug resistance[J].Biochim Biophys Acta，2007，1773 (8)：1263-1264.

[9]邓开玉，田小英.PTEN和K-ras与子宫内膜癌关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2011，18(15)：1217-1220.

[10] 喻小兰，卢科莲，夏纪毅，等.Ras、CyclinD1在宫颈癌中的表达及黄芩素对其表达的影响[J].继续医学教育，2014，28(2)：19-22.

[11]Coleman ML，MarshallCJ，Olson MF.Ras promotes p21 (Waf1/Cip1)protein stability via a cyclin D1-imposed block in proteasome-mediated degradation[J].EMBO J，2003，22 (9)：2036-2046.

[12]郭艳萍，杨广英，王建君.PTEN、STAT3和CyclinD1蛋白在宫颈癌中的表达及意义[J].中国妇幼保健，2012，27 (15)：2344-2346.

[13]胡成久，郭瑞珍.K-RAS蛋白的表达、基因突变在皮肤瘢痕癌组织中的意义[J].中国现代医学杂志，2013，23 (1)：22-253.

[14] 汪鑫，聂绍发，徐晓，等.大肠癌中p21基因表达的研究[J].九江医学，2003，18(2)：63-65.

[15] 白冬雨，张海萍，钟山，等.结直肠癌K-ras基因突变位点的检测及其临床意义[J].中国普通外科杂志，2012，21(10)：1222-1226.

[16]郭瑞珍，王海青，欧小波.Ras、MAPK、CyclinD1与皮肤瘢痕癌的相关性研究[J].临床与实验病理学杂志，2013，29(4)：393-397.

Objective To detect CyclinD1 and k-ras in cervical cancer tissue(experimental group)and in normal cervical tissue(control group)，and the differences in the expression level of CINⅠ，CINⅡ，and CINⅢ，to explore their function and possible molecular mechanisms in development and progression of cervical diseases and so as to provide theoretical basis for the study of the etiology of cervical cancer.Methods Immunohistochemistry was adopted to detect the expression status of CyclinD1 and k-ras among 15 cases with cervical cancer，20 cases with normal cervical tissue，18 cases with CINⅠ，12 cases with CINⅡand 20 cases with CIN，and the interrelation between CyclinD1 and k-ras and the development and progression of cervical diseases.Results The expression of CyclinD1 and k-ras was significantly higher in cervical cancer tissue than in normal tissue.With increasing clinical stage，the protein expression increased with differences of statistical significance(P＜0.05).The expression of CyclinD1 and k-ras was not statistically different in ages and the types of cervical cancer tissue(P＞0.05)，while the differences were of statistical significance in differentiation degree and lymphatic metastasis.The expression was 66.7%and 59.3%in poorly differentiated group，while 23.7%and 28.9%in highly and moderately differentiated group.It was 54.8%and 63.0%in lymphatic metastasis group，which was significantly positively correlated with the expression of CyclinD1 and k-ras. Conclusion It was closely related to the high k-ras and CyclinD1 protein expression and the occurrence of cervical cancer，and the various proteins play a role of synergies；Expression strenth of k-ras CyclinD1 in cervical diseases get enhanced，and both were significantly correlated.

CyclinD1；k-ras；Cervical cancer

2014-05-26)

1005-619X(2014)09-0775-03

10.13517/j.cnki.ccm.2014.09.004