HPLC法同时测定复方板蓝根利咽颗粒中6种成分

罗友华，杨 辉*，林雪晶，黄恺飞，许光辉，黄亦琦

(1.厦门市医药研究所厦门市天然药物研究与开发重点实验室，福建厦门 361008;2.福建中医药大学药学院，福建福州 350122)

复方板蓝根利咽颗粒是由板蓝根、玄参、桔梗、甘草等六味中药经提取加工制成的复方制剂，具有清热解毒、祛痰利咽的功效，用于咽喉肿痛、口咽干燥以及急、慢性咽喉炎和扁桃体炎见以上证候者的治疗［1］。该制剂已获福建省医院制剂批准文号 (闽药制字Z20120001)，临床使用疗效显著。

该制剂中，以板蓝根清热解毒、凉血利咽为君药，玄参清热凉血、滋阴降火、解毒散结和桔梗宣肺利咽、祛痰排脓共为臣药，甘草清热解毒、祛痰止咳为佐使药。该制剂质量标准中仅采用了薄层层析定性鉴别，难以有效反映中药复方制剂的质量。因此，本实验分别选择板蓝根、玄参、桔梗、甘草中的腺苷、(R，S)-告依春、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、甘草苷和甘草酸铵等特征有效成分作为复方板蓝根利咽颗粒水提液的指标成分，建立了HPLC法对其同时进行测定，旨在为及时检测并全面跟踪有效成分在复方板蓝根利咽颗粒制备过程中各工序的转移率提供一种高效方法，同时也为该中药复方的质量标准研究提供依据。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，包括低压梯度四元泵，自动进样器，恒温箱，DAD紫外检测器，Chem station色谱工作站 (美国 Agilent公司);XS205电子分析天平 (瑞士梅特勒-托利多公司，d=0.01mg)。

乙腈 (批号 12100484，色谱纯，TEDIA公司)，甲醇 (批号12090074，色谱纯，TEDIA公司)，磷酸 (批号20130104，分析纯，辽宁嘉城精细化学品有限公司)，正丁醇 (批号20081024，广东光华化学厂有限公司)，超纯水 (自制)。

腺苷 (批号 110879-200202，纯度 100%)、(R，S)-告 依 春 (批 号 111753-201103，纯 度99.5%)、甘草苷 (批号 111610-201005，纯度94.9%)、哈巴俄苷 (批号111730-201106，纯度96.0%)、桔梗皂苷D(批号111851-201204，纯度94.9%)、甘草酸铵 (批号110731-200614，纯度100%)等对照品均购自中国食品药品检定研究院。板蓝根、玄参、桔梗、甘草等药材均购自厦门燕来福制药有限公司，经本所杨辉副主任药师鉴定均符合《中国药典》2010年版要求。

2 方法

2.1 色谱条件 Agilent Zorbox Eclipse XDB-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脱 (0～10 min，3% ～10%A;10～14 min，10% ～18%A;14～22 min，18% ～24%A;22～30 min，24% ～27%A;30～34 min，27% ～28%A;34～35 min，28% ～33%A;35～40 min，33% ～50%A;40～45 min，50% ～80%A;45～47 min，80% ～100%A;47～48 min，100% ～3%A;48～50 min，3% ～3%A);检测波长为260 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min);体积流量1mL/min;柱温30℃;进样量为 10 μL。

2.2 对照品溶液的配制 分别称取腺苷2.76 mg、(R，S)-告依春2.56 mg、甘草苷3.84 mg、哈巴俄苷1.08 mg、桔梗皂苷 D 4.34 mg、甘草酸铵8.22 mg置于10 mL的量瓶中，加适量甲醇溶解后，用甲醇定容，摇匀即得混合对照品溶液，4℃冷藏备用。

2.3 供试品溶液的制备 按复方板蓝根利咽颗粒处方，称取板蓝根15 g、玄参5 g、桔梗5 g、甘草2 g等，按复方板蓝根利咽颗粒最佳提取工艺 (加8倍药材量的水，微沸提取3次，每次1 h，过滤后合并滤液即得)得复方板蓝根利咽颗粒水提液，并浓缩成110 mL，加入甲醇110 mL，摇匀，离心10 min(1200 r/min)，精密量取上清液20 mL，置水浴上蒸干，残渣加20 mL水溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，将正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移并定容至5 mL的量瓶中，摇匀，0.45 μm滤膜滤过即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 按复方板蓝根利咽颗粒处方，分别称取缺板蓝根、缺玄参、缺桔梗、缺甘草的复方药材，按“2.3”项下方法分别制备缺板蓝根、缺玄参、缺桔梗、缺甘草的阴性供试品溶液，4℃冷藏备用。

3 结果

3.1 方法专属性试验 在“2.1”项色谱条件下，所测6种有效成分与其他成分色谱峰均可基线分离(分离度大于1.5)，且阴性供试品无干扰。对照品、供试品及阴性供试品色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 线性关系的考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液67、100、200、500、1000、1667、3333、5000 μL分别置5 mL的量瓶中，加甲醇定容后摇匀，得系列混合对照品溶液。按“2.1”项色谱条件纪录色谱图及峰面积。以峰面积y为纵坐标，质量浓度x(mg/mL)为横坐标，得回归方程:腺苷y=12325x+24.11，r=0.9996;(R，S)-告依春y=67935x+154.08，r=0.9991;甘草苷y=15633x+48.40，r=0.9992;哈巴俄苷y=27735x+25.78，r=0.9991;桔梗皂苷 D y=1558.5 x+14.66，r=0.9991;甘草酸铵y=7283.5x+52.84，r=0.9991。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸铵分别在 0.0037～0.2760、0.0034～0.2547、0.0049～0.3644、0.0014～0.1037、0.0055～0.4119和0.0110～0.8220 mg/mL范围内具有良好线性关系。

3.3 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸铵峰面积的 RSD值分别为1.0%、1.0%、1.0%、1.0%、1.0%和1.0%。结果表明，仪器精密度良好。

3.4 重复性试验 取同一批号药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液5份，分别按“2.1”项下色谱条件测定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸铵峰面积的RSD值分别为0.9%、0.8%、0.1%、1.0%、1.7%、0.1%。结果表明，方法重复性良好。

3.5 稳定性试验 取同一批号 (批号20130401)供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12 h测定。腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸铵峰面积的RSD值分别为 1.4%、0.7%、0.4%、0.2%、1.8%和0.2%。结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

3.6 加样回收率试验 精密量取5000 μL已知含有量的复方板蓝根利咽颗粒水提液浓缩液 (批号20130301，各成分质量浓度分别为:腺苷0.0624 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0450 mg/mL，甘草苷0.0888 mg/mL，哈巴俄苷0.0227 mg/mL，桔梗皂D 0.0553 mg/mL，甘草酸铵0.1083 mg/mL)5份，分别精密加入已知质量浓度的混合对照品溶液［腺苷 0.0610 mg/mL，(R，S)-告依春 0.0421 mg/mL，甘草苷0.0844 mg/mL，哈巴俄苷0.0243 mg/mL，桔梗皂苷 D 0.0560 mg/mL，甘草酸铵0.1043 mg/mL］ 5000 μL，加入甲醇 10 mL，摇匀，离心10 min(1200 r/min)，小心取出上清液，置水浴上蒸干，残渣加20 mL水溶解，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移并定容至5 mL量瓶中，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，然后按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

3.7 样品测定 取3批药材，按“2.3”项下方法提取制备，进行测定，结果见表2。

4 讨论

4.1 现代研究表明，板蓝根主要含有生物碱类、有机酸类、多糖类、氨基酸类、核苷类等，其中腺苷等核苷类和表告依春等生物碱类均是其抗病毒的重要有效成分［2-4］;玄参主要含环烯醚萜类、苯丙素苷类，其中哈巴俄苷为玄参特征性有效成分，具有抗炎等作用［5-7］;桔梗主要有效成分为三萜皂苷类，桔梗皂苷D是其主要皂苷，具有祛痰作用［8］;甘草主要活性成分为甘草苷等甘草黄酮类和甘草酸等甘草皂苷类，具有抗炎、抗病毒、祛痰等活性［9］。这6种有效成分与复方板蓝根利咽颗粒的功效主治密切相关，故选择这6种成分进行测定。

4.2 在190～400 nm间分别对腺苷、(R，S)-告依春、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D和甘草酸铵溶液做紫外扫描，发现其分别在260、245、278、278、210、250 nm处有最大吸收，结合《中国药典》2010年版相关药材项下成分测定方法，根据这6种成分的保留时间，最终确定检测波长切换时间顺序为260 nm(0～10 min)、245 nm(10～14 min)、278 nm(14～34.5 min)、210 nm(34.5～35.5 min)、250 nm(35.5～50 min)。

4.3 在预试验中考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液等流动相，最终选择乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相，按本实验梯度洗脱程序，结果除桔梗皂苷D的色谱峰未基线分开外，其余各有效成分色谱峰均较好分开，保留时间也适中。又因桔梗皂苷D的响应值较低，易受其他杂质影响。所以，对复方板蓝根利咽颗粒水提液按“2.3”项下方法进行前处理，最终使桔梗皂苷D分离良好。

表1 加样回收率实验(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

4.4 中药成分的多样性、复杂性和作用机制的模糊性使中药质量控制仍存在许多问题，是中药现代化的瓶颈之一，中药的整体作用及多成分、多靶点的特点，决定了任何一个单一成分作为指标都不能准确反映中药复方制剂的质量［10］。应用现代分析技术实现中药复方有效成分群的多指标成分检测，是中药质量控制的发展趋势［11-15］。因此，本实验建立的同时测定复方板蓝根利咽颗粒水提液中6种有效成分的HPLC法，为其今后生产质量控制研究提供了依据。

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