LC-MS法测定川楝子中川楝素

罗文汇，毕晓黎，孙冬梅

(广东省中医药工程技术研究院，广东广州 510095)

川楝子为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实。味苦，性寒;有小毒。具疏肝泄热、行气止痛、杀虫的功效，用于肝郁化火、胸胁、脘腹、疝气疼痛、虫积腹痛，被收载于《中国药典》2010年版一部［1］。

目前，对川楝子中三萜类研究较多的是川楝素，川楝素具有驱虫、抗癌、抗菌、影响神经肌肉及细胞、影响呼吸中枢及消炎等多种生物活性［2-3］，目前文献报道多采用HPLC-UV方法对川楝子药材及其制剂中的川楝素进行测定［4-12］。本实验拟用LC-MS法对川楝子药材中川楝素进行测定，所建立的方法简便，快速，灵敏，为控制川楝子药材的质量，提供了一个良好基础。

1 仪器与试药

Accela高效液相色谱仪、TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱检测器 (美国Thermo Fisher Scientific公司);Advantage A10超纯水处理系统 (美国Millipore公司);乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯 (Merck公司);高纯氮气 (纯度＞99.999%)、高线氩气 (纯度＞99.999%);水为超纯水;川楝子 (批号分别为YL110204、YL110309、Y120314、YL120519、TP1206003、TP120825)由广东一方制药有限公司提供，经本院刘法锦研究员鉴别为《中国药典》2010年版一部收载品种;川楝素对照品 (批号111842-201001)购于中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil GOLD C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm，3 μm);柱温30℃;流动相乙腈-0.01%甲酸 (31∶69);体积流量0.2 mL/min;进样量2 μL。

2.2 质谱条件 高温电喷雾离子源 (HESI源);负离子选择反应监测 (SRM);喷雾电压3.5 kV;喷雾温度350℃;毛细管温度300℃;鞘气压力35 psi(1 psi=6.895 kPa);辅助气体积流量1.5 L/min;用于定量分析的离子为m/z 573(12v)。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取川楝素对照品12.36 mg，加甲醇溶解，定容至100 mL量瓶内，摇匀，得123.6 μg/mL的对照品贮备液，置4℃冰箱中保存，使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

2.4 供试品溶液的制备［1］取本品粉末约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，再用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，即得。

2.5 线性关系考察 精密吸取不同体积的川楝素对照品溶液分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1.24、3.71、6.18、9.89、12.36 μg/mL系列溶液，分别取2 μL，注入LC-MS联用仪，以川楝素的两个峰面积之和 (Y)对质量浓度 (X)进行线性回归，得回归方程为Y=3750X+32400，r=0.9949。川楝素在 (1.24～12.36 μg/mL)范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 选取3.71 μg/mL的川楝素对照品溶液分别进样6次，进样量2 μL，按照“2.1”项和“2.2”项实验条件进行测定，记录质谱峰面积，结果川楝素两个峰面积之和RSD为2.50%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 取川楝子样品0.25 g，按照“2.4”项试验方法进行制备供试品溶液，“2.1”项和“2.2”项试验条件进行测定，分别于0、1、2、4、8、12、24 h测定，记录质谱峰面积，考察稳定性。结果川楝素两个峰面积之和的RSD为2.19%，样品在24 h内稳定。

2.8 重复性试验 分别称取6份川楝子样品各0.25 g，按照“2.4”项试验方法进行制备供试品溶液，“2.1”项和“2.2”项试验条件进行测定，记录质谱峰面积，测得川楝子供试品中川楝素两个峰面积之和的RSD为2.38%。

2.9 加样回收率试验 取已知量的同一批川楝子供试品9份各0.125 g，分别精密加入一定量的川楝素对照品溶液，按照“2.4”项供试品溶液制备方法进行操作，“2.1”项和“2.2”项实验条件进行测定，测得川楝子供试品平均加样回收率为97.96%，RSD为3.01%，见表1。

表1 川楝素回收率测定结果

2.10 样品测定 取川楝子供试品各6份，按照“2.4”项实验方法进行操作，“2.1”项和“2.2”项实验条件进行测定，按外标法以川楝素两个峰面积之和定量，代入线性回归方程，计算川楝子中川楝素。结果川楝子供试品中川楝素的质量分数为 (0.734±0.037)mg/g，RSD为2.05%。见图1～2。

图1 川楝素对照品TIC图谱

图2 川楝子药材TIC图谱

3 讨论

川楝素的毒性作用之一为肌无力，但在去神经骨骼肌上，川楝素则能增强直接刺激引起的收缩反应［13］。由于川楝子的广泛生理活性和临床应用，其存在的急性和慢性的毒性作用不应忽视，对川楝素量需要控制。川楝素结构中具有半缩醛，始终有两个互变异构体存在［14-15］，故定量时以川楝素两个峰面积之和计算。本实验采用液质联用的方法测定川楝子中川楝素的量，方法灵敏、准确，重复性好，为川楝子的质量控制提供了实验依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:39.

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［3］王小娟，刘妍如，肖炳坤，等.川楝素抗肿瘤作用机制研究进展［J］.科学技术与工程，2011，11(2):281-285.

［4］李洁玉，沈 力，周 浓，等.HPLC测定不同来源川楝子中川楝素［J］.光谱实验室，2013，30(1):294-297.

［5］周乐华，李迎春，窦志英.川楝子及其炮制品中川楝素含量测定研究［J］.天津药学，2011，23(1):20-22.

［6］胡 芳，容 伟，周 英，等.川楝韧皮和川楝子中川楝素含量比较研究［J］.时珍国医国药，2011，22(5):1115-1117.

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［11］张秋蓉，周 浓，杨 敏.HPLC测定乙肝宁颗粒中川楝素［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(10):78-79，82.

［12］刘红亚，崔红梅，周 绚.RP-HPLC法测定川楝子药材中川楝素的含量［J］.世界科学技术—中医药现代化，2008，10(3):52-54.

［13］陈 兵.川楝子的现代研究进展［J］.中国中医药现代远程教育，2010，8(12):259-261.

［14］钟炽昌，谢晶曦，陈淑凤，等.川楝素的化学结构［J］.化学学报，1975，33(1):35-47.

［15］舒国欣，梁晓天.关于川楝素化学结构的修正［J］.化学学报，1980，38(2):196-198.