当归贝母苦参丸对顺铂化疗H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及对血清HIF-1α和LDH的影响

闫德祺，刘永琦，2，3*，李应东，李 豆，蔺兴遥，伍志伟，颜春鲁

(1.甘肃中医学院系统生物学与中医药转化研究所，甘肃兰州 730020;2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室中西医结合基础室，甘肃兰州 730020;3.敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃兰州 730020)

恶性肿瘤严重危害人们的生命健康，患者死亡率高。恶性肿瘤在中医学中多属积的范畴，按发病进展分为气滞血阻、瘀血内结、正虚瘀结3个证型，分别予以理气通络、活血消积;祛瘀软坚、调理脾胃;补益气血、活血化瘀。当归贝母苦参丸首见于《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治第二十》，该方由当归、贝母、苦参三味药物组成，具有养血和血、清热燥湿、化痰散结、利窍开闭之功效。现代医家将当归贝母苦参丸运用于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌等疾病的治疗中，取得了较好的临床疗效［1，2］。本课题研究了当归贝母苦参丸对KM小鼠皮下移植瘤的抑瘤作用及对顺铂化疗的增效减毒作用，检测了荷瘤小鼠血清中的低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)水平和乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase，LDH)的活力。

1 材料

1.1 动物 SPF级昆明小鼠100只，雌雄各半，体质量20～22 g，由甘肃中医学院SPF级动物实验中心提供;动物合格证号 SCXK(甘)2011-0001;SPF级动物实验设施使用证号 SYXK(甘)2011-0001。

1.2 细胞株 H22肝癌瘤株由甘肃中医学院中西医结合研究所传代培养。

1.3 药物与试剂 CO2培养箱 (法国NAPCO公司)，RPMI1640(美国 Invitro公司);顺铂注射液，10 mg/支，齐鲁制约有限公司 (批号201002CF);HIF-1α试剂盒，上海源叶生物科技有限公司 (批号20121001A);LDH试剂盒，南京建成生物工程研究所 (批号20121011)。当归贝母苦参丸为自制汤剂 (每1 mL药液相当于0.45 g生药，当归、贝母、苦参各0.15 g/mL)。

1.4 仪器 SW-CJ-IF超净台 (中国苏州净化设备厂);电子天平 (LD100001，龙腾电子有限公司);Abacus Junior vet 5动物血清分析仪 (兰桥医疗);酶标仪 (680型，美国BD-RAD公司);UV1101紫外-可见分光光度仪 (上海天美科学有限公司)。

2 方法

2.1 当归贝母苦参丸汤剂的制备 将当归、贝母、苦参饮片各15 g放在陶土药锅中，加500 mL去离子水浸泡30 min，煎药1 h，将药液倒入烧杯中，再加500 mL去离子水浸泡30 min，煎药1 h，将两次煎出液混合后在水浴锅中水浴加热浓缩到100 mL，高压灭菌。药物质量浓度按生药量计算为0.45 g/mL。

2.2 动物模型制备 KM小鼠适应环境4 d后，按随机数字表法分出雌雄各8只，设为正常对照组，其他小鼠造模。取传代9 d的腹水型 H22小鼠腹水离心弃上清，用生理盐水调至细胞密度为2×106个/mL。将H22肝癌细胞悬液 0.2 mL接种于昆明小鼠右前腋皮下，细胞计数约为4×105个，以出现皮丘为皮下接种部位正确。观察小鼠接种部位的肿瘤生长情况5～7 d，接种部位可触及结节为接种成功［3］。

2.3 模型动物分组及处理 第8天剔除接种不成功的小鼠［3］，随机挑选接种成功的小鼠，雌雄各32只随机分为模型对照组、顺铂组、当归贝母苦参丸组和当归贝母苦参丸加顺铂组，每组雌雄各8只。分组后称定质量，模型对照组灌胃和腹腔注射生理盐水0.4 mL/20 g，0.2 mL/20 g;顺铂组灌胃生理盐水0.4 mL/20 g，以2.0 mg/(kg·d)腹腔注射顺铂0.2 mL/20 g;当归贝母苦参丸组以9 g/(kg·d)灌胃0.4 mL/20 g当归贝母苦参丸药液，腹腔注射生理盐水0.4 mL/20 g;当归贝母苦参丸加顺铂组以9 g/(kg·d)灌胃当归贝母苦参丸药液，腹腔注射2.0 mg/(kg·d)顺铂0.2 mL;连续给药14 d。

2.4 指标检测

2.4.1 小鼠一般状态观察及计算 观察小鼠生存状态，记录小鼠的神态、发育、营养、活动、饮食、二便等，反映小鼠的一般情况。记录开始给药第1天和处死时的体质量，计算治疗前后的体质量变化。体质量变化=处死时的体质量-分组给药时的体质量。有效体质量变化=处死时的体质量-肿瘤质量-分组给药时的体质量。

2.4.2 计算抑瘤率、q值、肿瘤指数、器官指数剥离瘤体组织，摘取肝、脾、肾、胸腺后分别称质量。计算抑瘤率、肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺等的指数。抑瘤率 (%)=(模型对照组平均瘤质量 -实验组平均瘤质量)/模型对照组平均瘤质量。q=EAB/［EA+(l-EA)EB］。式中EA为A药(当归贝母苦参丸)抑瘤率，EB为B药 (顺铂)抑瘤率，EAB为联合用药组两药合用的抑瘤率，q=0.85～1.15为两药作用相加，q＞1.25为两药作用增强 (或协同)，q＜0.85为两药拮抗［4］。器官指数=器官质量 (mg)/体质量 (g)。

2.4.3 血常规检测 在1.5 mL离心管中加入生理盐水80 μL，滴加20 μL新鲜血液，以动物血清分析仪检测血常规。

2.4.4 HIF-1α和LDH检测 按照ELISA试剂盒说明书检测血清HIF-1α，按照血生化说明书检测血清LDH。

2.5 统计学处理 样本实验数据以 (平均值±标准差)表示，应用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 荷瘤小鼠的一般状况 接种成功后，瘤块体积逐渐增大，外观呈球形。初期能活动，后来大多逐渐变硬。分组前荷瘤小鼠身形较匀称 (瘤体隆起处除外)，动作敏捷，反应灵活，皮毛光滑，进食进水较正常;分组7 d，随着实验时间的继续延长，顺铂组小鼠最先出现精神萎靡，饮食活动减少，聚集一团，皮毛成揪失去光泽，下腹部不洁净，尿液变黄等现象。模型组负荷瘤体最大，活动减少。给药结束时各组小鼠一般状况从正常到差排序:正常组、当归贝母苦参丸组、当归贝母苦参丸加顺铂组、模型组、顺铂组。

3.2 各组小鼠疗前后体质量和有效体质量的变化见表1。

表1 各组小鼠体质量及有效体质量变化比较 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

表1 各组小鼠体质量及有效体质量变化比较 ()Tab.1 Changes in body weight and tumor-free body weight of each group()

注:与空白对照组比较，●P ＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05;与顺铂组比较，ΔP＜0.05;与当归贝母苦参丸组比较，▲P ＜0.05

有效体质量变化空白对照组组别 样本数 首次给药体质量/g 处死时体质量/g 体质量变化/g 16 31.8±1.2 40.0±2.8 8.1±2.4 8.1±2.4模型对照组 16 29.4±0.9 37.5±1.2 8.1±1.2 2.5±1.7●顺铂组 16 29.8±1.3 22.5±1.2● -6.3±2.2●＊ -8.5±2.3●＊当归贝母苦参丸组 16 29.6±1.1 35.6±3.0Δ 6.1±2.4Δ 2.7±1.9Δ当归贝母苦参丸加顺铂组 16 29.4±1.3 26.9±1.8●＊▲ -2.5±1.3●＊Δ▲ -4.3±1.4●＊Δ▲

3.4 荷瘤小鼠器官指数比较 见表3。

3.5 荷瘤小鼠白细胞计数比较 见表4。

3.6 荷瘤小鼠血清HIF-1α水平和LDH活力 见表5。

表2 各组瘤体质量 ()及抑瘤率的比较Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

表2 各组瘤体质量 ()及抑瘤率的比较Tab.2 Tumor weight()and tumor inhibition rate of each group

注:与模型组比较，*P＜0.05;与顺铂组比较，ΔP＜0.05;与当归贝母苦参丸组比较，▲P ＜0.05

组别 样本数 瘤体质量/g 肿瘤指数/(mg·g-1) 抑瘤率/%16 5.5±1.3 148.6±35.9顺铂组 16 2.2±0.6* 93.0±24.4* 60.0当归贝母苦参丸组 16 3.4±1.0*Δ 95.1±19.4* 38.2当归贝母苦参丸加顺铂组 16 1.8±0.6*Δ 66.9±11.8*Δ，▲模型对照组67.2

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数、胸腺指数 ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

表3 肝癌H22荷瘤小鼠肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数、胸腺指数 ()Tab.3 Indexes of liver，kidney，spleen，thymus of each group()

注:与空白对照组比较，●P＜0.01;与模型对照组比较，*P＜0.01;与顺铂组比较，ΔP＜0.05;与当归贝母苦参丸组比较，▲P＜0.05

组别 样本数 肝脏指数/(mg·g-1) 脾脏指数/(mg·g-1) 肾脏指数/(mg·g-1) 胸腺指数/(mg·g-1)16 39.8±8.0 3.5±0.5 5.0±1.2 3.0±0.9模型对照组 16 69.2±7.2● 10.3±3.4● 4.8±1.0 2.8±0.6顺铂组 16 53.9±8.9 2.3±0.7* 5.2±0.8 0.8±0.2●当归贝母苦参丸组 16 67.9±9.8● 11.5±4.4●Δ 5.3±0.8 2.5±0.6Δ当归贝母苦参丸加顺铂组 16 66.1±6.8● 3.5±0.5＊▲ 5.3±0.8 1.3±0.4●＊Δ▲空白对照组

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白细胞计数 (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

表4 肝癌H22荷瘤小鼠白细胞计数 (n=10，)Tab.4 Blood white cell count of each group(n=10，)

注:与空白对照组比较，●P＜0.01;与模型对照组比较，*P＜0.01;与顺铂组比较，ΔP＜0.05;与当归贝母苦参丸组比较，▲P＜0.05

组别 白细胞/(109·L-1) 淋巴细胞/(109·L-1) 单核细胞/(109·L-1) 中性粒细胞/(109·L-1)3.74±1.52 2.32±0.93 0.13±0.13 1.30±0.27模型对照组 24.68±1.37● 15.57±1.40● 1.46±0.65● 7.67±1.6●顺铂组 6.16±1.65●＊ 4，97±1.60●＊ 0.06±0.04●＊ 1.11±0.80*当归贝母苦参丸组 11.74±3.9●＊Δ 5.20±0.87●＊ 0.49±0.58●＊Δ 6.05±3.30●Δ当归贝母苦参丸加顺铂组 7.06±1.11●＊▲ 4.20±1.09●＊ 0.32±0.17●＊Δ 2.54±1.64●＊Δ▲空白对照组

表5 各组小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比较 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

表5 各组小鼠血清HIF-1α水平、LDH活力比较 ()Tab.5 HIF-1α serum level and LDH activity of each group()

注:与空白对照组比较，●P＜0.05;与模型组比较，*P＜0.05;与顺铂组比较，ΔP＜0.05

组别 样本数 HIF-1α/(pg·mL-1) LDH/(μ·L-1)10 4.061±0.640 3999.35±295.55模型对照组 10 7.298±0.838● 3631.56±262.03顺铂组 10 3.443±1.159* 7456.70±506.58●＊当归贝母苦参丸组 10 4.842±0.470* 3837.41±1069.62Δ当归贝母苦参丸+顺铂组 10 3.769±0.877* 3791.45±1048.28空白对照组Δ

4 讨论

本研究中小鼠移植瘤于注射瘤细胞悬液5～7日形成，符合中医湿浊癌毒瘀久化热，导致痰浊凝结，脾失健运，不能升清化生精微，气血生化乏源，气血阴阳失调，气虚无力推动血液运行，气滞痰凝、瘀血内停，癌毒客居发展而生积聚的理论。治当活血化瘀，化痰散结，清热燥湿，攻癌杀毒，符合《内经》“坚者消之，留者攻之，结者散之，客者除之”及“热者寒之”的原则。当归贝母苦参丸始载于《金匮要略》，由当归、贝母、苦参等比例组成，具有养血和血、化痰散结、清热燥湿的功效。顺铂攻杀癌毒力强，为君药。顺铂性热易耗伤阴津气血，炼液生痰，臣以当归养血活血维持气血通畅，佐以贝母清热化痰保护肺脏布散津液、苦参清热燥湿维持脾脏生化气血，能收到较好抗癌疗效。

精血同源，皆由水谷精气化生或培育补充，二者可相互滋生和转化。当归具有补血的功效，血旺使心肌等组织得到濡养，减少顺铂所致心肌组织损伤［5］。血能生精，使肾有所藏，肾气则旺。肾气健旺，则肾主骨生髓的功能得以恢复，为减轻顺铂化疗引起的西医上的肾毒性［6-7］、耳毒性［8-9］、性腺抑制［10］、骨髓抑制［11］、神经毒性［12-13］提供了中医学依据。苦参苦寒配以甘温制其性味，使燥湿之功力专，有益于脾胃后天之本功能的发挥，减轻顺铂引起的恶心、厌食、呕吐等消化系统症状，增加顺铂化疗荷瘤小鼠的体质量，改善荷瘤小鼠的生存状态。现代研究表明当归及其萃取物当归多醣能够提高机体细胞和体液免疫［14］。苦参碱和苦参酮能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤转移，调节免疫功能［15］。当归贝母苦参丸能够拮抗顺铂化疗引起的脾脏指数和胸腺指数降低，有升高脾脏指数和胸腺指数的作用，对荷瘤小鼠重要免疫器官具有一定的保护作用，可能与调节免疫的活性成分有关。

恶性肿瘤的治疗疗效与肿瘤细胞耐受缺氧的能力及化疗损伤有关。HIF-1α是细胞对低氧的适应性反应，能够促进肿瘤组织代谢产物的清除及血管生成，其表达激活有助于肿瘤血管的生成和肿瘤细胞的转移，预后差［16］。HIF-1α是肿瘤治疗的靶点之一，各给药组HIF-1α的水平下调，使肿瘤细胞耐受低氧的肿瘤微环境能力下降，影响肿瘤细胞内代谢产物的清除，有利于抑制肿瘤的生长［17］。Elberry等［18］的研究结果表明，对大鼠应用顺铂72 h后可以检测到明显的肾脏组织病理损伤，血清LDH水平显著升高，与本实验顺铂组血清LDH水平升高一致，而当归贝母苦参丸加顺铂组未检测出LDH水平升高，或许与其减轻了顺铂损伤组织的程度有关。

研究具有抑瘤作用及对化疗药物具有增效减毒作用的中药及其复方逐渐成为中医药研究的热点。

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