蛇足石杉茎尖组织培养研究△

李晓君，杨雪飞，朱皖南，罗建平*

(1. 合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.宁国市金达生物科技有限公司，安徽 宁国 242300)

中药农业

安徽省自然科学基金(00041508)

*

罗建平，教授，博士生导师，研究方向：中草药与功能食品；Tel：13095518428，E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn

蛇足石杉茎尖组织培养研究△

李晓君1，杨雪飞1，朱皖南2，罗建平1*

(1. 合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.宁国市金达生物科技有限公司，安徽 宁国 242300)

目的研究蛇足石杉茎尖组织培养条件，建立组织快繁体系。方法通过添加不同浓度的蔗糖及植物激素改良基础培养基，考察其对蛇足石杉茎尖诱导丛生芽和GGB(绿色小体)，GGB的分化以及丛生芽生根的影响。结果诱导茎尖发生丛生芽和GGB的最适宜培养基分别为MS+2%蔗糖和MS+4%蔗糖；将GGB转接在MS+2%蔗糖培养基中，平均每团GGB可分化出16株丛生芽；在改良MS+10 μmol·L-1IBA生根培养基中，全部丛生芽再生健壮的根系，再生植株的移栽成活率可达80%。HPLC检测表明，组织快繁的蛇足石杉植株具有石杉碱甲合成能力，其含量为607.40±30.75 μg·g-1，与野生植株相当。结论初步建立蛇足石杉组织快繁体系，扩大了蛇足石杉种质资源，并为石杉碱甲的合成途径提供了研究基础。

蛇足石杉；茎尖；组织培养；GGB；丛生芽

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.)Trev属石杉科石杉属，又名千层塔，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分石杉碱甲(huperzine A)是一种低毒、高效、可逆且具有高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，临床上用于治疗重症肌无力、老年痴呆症和精神分裂症等[1-2]。但蛇足石杉野生植株生境特殊，生长缓慢，加之开采过度，面临资源枯竭的危机[3]。

近年来，许多单位对扦插繁殖、芽孢繁殖和组织快繁再生蛇足石杉药用资源展开了探索研究[4-6]。在组织快繁方面，由于内生真菌的存在，早期的研究集中在外植体灭菌方法的筛选[7]，近年相继有蛇足石杉孢子萌发[8]、茎尖培养[9]、愈伤组织诱导[10]的报道，但尚未建立一套可行的由外植体到完整植株的再生体系。本文对蛇足石杉茎尖培养快繁植株的技术体系进行了研究，以期为再生蛇足石杉种质资源及实现人工规模化栽培提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.)Trev采自安徽省九华山，由中国科学技术大学顾月华教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 外植体的灭菌与培养 切取蛇足石杉孢子体茎尖(1.5～2.0 cm)，按前文方法[7]进行表面灭菌。灭菌后的茎尖接种到MS培养基(附加2%蔗糖、6.0 g·L-1琼脂)上，置于25 ℃、光照时间12 h·d-1、光照强度2 000 lx环境下培养。

1.2.2 丛生芽和绿色小体(green globular body，GGB)的诱导 切取长约5～8 mm新生顶芽接种至含不同蔗糖浓度的MS培养基上，每组接种30个芽，重复3次。培养3个月后，统计丛生芽和GGB的诱导率。

1.2.3 GGB的增殖和丛生芽分化 将GGB转至附加2%蔗糖、6.0 g·L-1琼脂的MS培养基上培养3个月，统计GGB的增殖和丛生芽分化。

1.2.4 生根培养和移栽 分离丛生芽，并转至附加不同浓度IBA的改良MS(1/4标准MS矿质元素+1/2标准MS有机成分)和B5培养基中，光照培养2个月，观察记录其对幼芽生根的影响。所有生根培养基中均添加2%蔗糖、6.0 g·L-1琼脂。挑选生根良好的完整植株，经1～2 d炼苗后转入栽培基质(碎树皮1∶泥炭土3∶珍珠岩1)中进行移栽。

1.2.5 石杉碱甲含量检测 分别取蛇足石杉野生植株(春季)和茎尖再生植株(培养5个月)茎叶于60 ℃烘干至恒重，粉碎过20目筛，取20 mg粉末按邵浩等[11]的方法提取石杉碱甲。提取液经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC色谱柱：Merck PurospherR C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(80∶20)；流速：0.5 mL·min-1；检测波长：308 nm，柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 外植体的生长

野生蛇足石杉茎尖外植体经表面灭菌后，在MS培养基上培养3周后，将无菌外植体转接至新鲜培养基上培养，3个月后约60%茎尖顶芽伸长生长约5～8 mm，部分茎尖分叉生长形成2个新芽(见图1-A)。

A：茎尖顶芽伸长生长 B：顶芽诱导产生丛生芽 C：顶芽诱导形成GGB(右上角为GGB扫描电镜图) D：GGB增殖分化丛生芽 E：丛生芽生根 F：移栽图1 蛇足石杉茎尖快繁植株过程

2.2 茎尖新芽诱导再生丛生芽和GGB

将茎尖外植体上的新生顶芽接种至附加不同激素的MS培养基上，芽可以缓慢生长，但无丛生芽和GGB出现。转移到基本MS培养基中，可见丛生芽和GGB的发生，它们的诱导形成受培养基中蔗糖浓度的调节(见表1)。当蔗糖浓度为1%时，芽全部白化死亡，提高蔗糖浓度，芽伸长生长，并在基部产生丛生不定芽(见图1-B)。在2%蔗糖时，所有转接的新芽均发生丛生不定芽。当蔗糖浓度为2～4%时，转接的新芽在顶端和基部均出现GGB，GGB的发生率依蔗糖浓度提高而提高，低浓度时以顶端GGB为主，高浓度时以基部GGB为主(见图1-C)。

表1 MS培养基中蔗糖浓度对茎尖新芽诱导丛生芽和GGB的影响

注：不同的小写字母表示差异显著，P<0.05(表2同)。

2.3 GGB再生丛生芽

将新诱导产生的GGB转接至基本MS培养基，2周后可见GGB颜色由暗淡的深绿色逐渐变成有光泽的亮绿色，4周后GGB体积开始明显增殖，培养至3个月，GGB可增殖4～6倍。GGB在增殖的同时，其表面开始分化形成丛生芽(见图1-D)，3个月后，平均每团GGB可分化形成16个丛生芽。实验中发现：(1)基本培养基中添加激素会抑制GGB增殖和丛生芽分化；(2)分化的GGB在切除丛生芽后可继续增殖并分化出新的丛生芽；(3)若将GGB切割成小块后接种至新鲜培养基，GGB未见增殖并逐渐褐化死亡。

2.4 植株再生和移栽

将生长至1 cm高的丛生苗分离后接种至含不同浓度IBA的MS和B5培养基中诱导根的再生(见表2)。表2的数据表明，在基本培养基中，MS比B5更有利于丛生苗根的诱导和生长；在改良MS培养基中添加IBA可显著影响根的生长，对根生长最适合的浓度是10 μmol·L-1，此时根白色、健壮，植株生长旺盛(见图1-E)。将生根的完整植株经炼苗后移栽至栽培基质中，覆膜保湿2周后去膜，大约4～5周后多数植株顶端开始生长，2个月后移栽成活率约为80%(见图1-F)。

表2 不同浓度的IBA和培养基对丛生芽生根的影响

2.5 再生植株中石杉碱甲测定

HPLC分析显示(见图2)，组培快繁植株和野生植株均出现和石杉碱甲标准品保留时间相同的洗脱峰，表明蛇足石杉茎尖经丛生芽途径或经GGB分化丛生芽途径再生的植株具有合成石杉碱甲的能力，且合成能力与野生蛇足石杉相当，其中4月份野生蛇足石杉的石杉碱甲含量为512.92±60.86 μg·g-1，生长5个月的快繁植株中石杉碱甲含量为607.40±30.75 μg·g-1。

A：石杉碱甲标品 B：野生蛇足石杉 C：快繁植株图2 石杉碱甲HPLC图

3 讨论

在蛇足石杉组织培养的研究中，Wojciech等[6]筛选出外植体存活并可生长的最适培养基，沈晓霞等[7]通过茎尖诱导出愈伤组织，包日双等[8]通过野生孢子诱导出原叶体并进行了再分化研究，但这些研究均未建立起蛇足石杉组织培养快繁体系。本研究发现蛇足石杉茎尖在适宜的条件下可以通过两种途径再生植株：一是茎尖直接分化出丛生苗再生植株；二是茎尖先脱分化形成GGB，再由GGB再分化出丛生苗再生植株。

GGB是蕨类植物形态发生中出现的一种特有结构，可以分化出新的植株，是许多蕨类植物组织快繁的必经阶段[12-14]，但在蛇足石杉组织培养中还是首次发现。本实验研究中，培养基中的蔗糖浓度对GGB的发生有一定的影响，一定范围内蔗糖浓度越高，GGB的发生率越高，分析可能是GGB的发生需要较多的碳源进行前期物质积累。当改良MS培养基中附加的蔗糖浓度为4%时，其GGB诱导率可达20%。GGB经整体分离后继续培养，能够增殖分化形成丛生苗，平均每个GGB分化出16个丛生芽，繁殖系数较高。另外，在丛生苗生根研究中发现基本MS培养基相对于B5培养基更适宜生根，且激素IBA对根的生长有显著性的影响，较高或较低浓度的IBA均不利于丛生苗生根，在添加10 μmol·L-1IBA的MS培养基中丛生苗生根状态最佳。

本实验初步建立了GGB→丛生苗→完整植株的组织快繁体系，为高效快繁蛇足石杉奠定了基础；同时，该快繁体系再生的蛇足石杉植株具有野生植株同样的石杉碱甲合成能力，也为解析石杉碱甲的生物合成途径提供了一种研究方式。

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PlantRegenerationofHuperziaserratabyRapidPropagationofShootTips

LIXiaojun1，YANGXuefei1，ZHUWannan2，LUOJianping1*

(1.ShoolofBiotechnologyandFoodEngineering，HeFeiUniversityofTechnology，Hefei230009，China；2.NingguoJindaBiologicalTechnologyCo.，Ltd，Ningguo242300，China)

Objective：Factors influencing rapid propagation ofHuperziaserratashoot tips was investigated to establish an efficient system for its plant regeneration.MethodsThe basal medium was supplemented with different concentrations of sucrose and plant growth regulators.The induction of multiple shoots and green globular bodies(GGBs)，the differentiation of GGBs as well as the rooting of multiple shoots was determined.ResultsOn the basal MS medium supplemented with 2% sucrose，all shoot tip explants could be effectively induced to differentiate multiple shoots.On the basal MS medium supplemented with 4% sucrose，approximately 20% shoot tip explants were induced to produce GGBs.When GGBs were transferred onto the basal MS medium supplemented with 2% sucrose，the average 16 multiple shoots per GGB could be obtained.On the modified MS medium supplemented with 10 μmol·L-1IBA，all multiple shoots regenerated strong roots and the transplanting survival rate of whole plants might reach 80%.The HPLC assay showed that the regenerated plants ofH.serrataby rapid propagation had the ability to synthesize huperzine A and the content of huperzine A was 607.40±30.75 μg·g-1，which was near to that of wild plants.ConclusionThe efficient rapid propagation technique was established to provide a foundation for the sustained utilization ofH.serratagermplasm resources and the analysis of the biosynthesis pathway of huperzine A.

Huperziaserrata；Shoot tips；Tissue culture；GGB；Multiple shoots

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.010

2013-10-27)