淡竹叶提取液对酪氨酸酶抑制作用研究△

齐美娜，林冰，杨航，祁灯响，周礼青

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 中药天然药研发中心，贵州 贵阳 550025)

中药工业

贵州省科技厅重点实验室计划项目(黔科合计Z字[2010]4015)；贵州省高校工程技术研究中心建设项目(黔教合KY字[2012]018号)；贵州大学大学生“SRT计划”项目[贵大SRT字(2012)68号]

*

林冰，副教授，研究方向：中药质量标准及中药材开发利用；E-mail：362570847@qq.com

淡竹叶提取液对酪氨酸酶抑制作用研究△

齐美娜1*，林冰1，2，3*，杨航1，祁灯响1，周礼青1

(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 中药天然药研发中心，贵州 贵阳 550025)

目的研究淡竹叶提取液对酪氨酸酶的抑制作用，并以此优选提取工艺。方法以酪氨酸酶抑制率为评价指标，通过正交试验法对超声提取淡竹叶的工艺进行优选。结果淡竹叶的最佳提取工艺条件是60%的乙醇，超声功率为90 W，超声提取50 min。此条件下提取物对酪氨酸酶的抑制率可达78.0%，IC50值为6.27 g·L-1。结论淡竹叶提取液来源广泛，提取方便，经济有效，可为开发植物源酪氨酸酶抑制剂提供一种新的选择。

淡竹叶提取液；酪氨酸酶；抑制效果；正交试验

淡竹叶LophatherumgracileBrongn.为禾本科多年生草本植物，广泛分布于江苏、浙江、江西、广西、湖南、福建等地，并且在许多地区均有栽培，资源十分丰富[1]。酪氨酸酶(tyrosinase)是体内合成黑色素的关键酶，它有两个主要功能：一是作为单酚酶，羟基化单酚生成邻二酚；二是作为双酚酶，氧化邻二酚生成邻醌[2]，邻醌再经过一系列复杂反应生成黑色素[3]。酪氨酸酶抑制剂可以抑制黑色素生成，在化妆品领域有广泛的应用，此外，在医药、食品及农业抗虫领域也有应用[4]。已有研究表明黄酮类化合物均对酪氨酸酶有一定的抑制作用[5]，而淡竹叶中含有丰富的黄酮类化合物[1]。目前国内学者对淡竹叶提取物的研究多集中于抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面，对于其对酪氨酸酶的抑制鲜有报道。本文选取邻苯二酚为底物，测定淡竹叶提取液对双酚酶的抑制作用，以酪氨酸抑制率为评价指标，采用正交试验的方法，对淡竹叶超声提取工艺进行优选。

1 仪器与试药

紫外分光光度计(UV-1801，北京北分瑞利分析仪器)；电热鼓风恒温干燥箱(DGG-9246A型，上海齐欣科学仪器有限公司)；高速台式冷冻离心机(TGL-18M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；手持式高速均质机(FJ150，上海标本模型厂)；旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平(莆田市亚太计量仪器有限公司，显示分度值：0.001 g)；万能粉碎机(FW100型，天津市泰斯特仪器有限公司)，超声波仪(KH-500DE型，昆山禾创超声仪器有限公司)，移液枪(Tegen Beta，100～1 000 μL)；数显恒温水浴锅(HB-8，上海梅香仪器有限公司)。

淡竹叶鲜品采收于贵州省贵阳市花溪区，经贵州大学熊源新教授鉴定为禾本科植物淡竹叶LophatherumgracileBrongn.；新鲜土豆购于贵州省贵阳市花溪区；邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯；蒸馏水。

2 方法

2.1 材料预处理

新鲜土豆保存于4 ℃冰箱中，于使用前去皮洗净切碎。淡竹叶鲜品切成小段于干燥箱中干燥至含水率约为10%，用粉碎机粉碎后过二号筛备用。

2.2 酪氨酸酶溶液的制备

取处理好的土豆样品25 g置于100 mL的烧杯中，加入0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)50 mL，用均质机均质2～3 min，再用6层纱布过滤，滤液用冷冻离心机离心5 min，取上清液备用[6]，以下简称酶液。

2.3 酪氨酸酶溶液最大吸收波长测定

于试管中依次精密加入0.1 mL酶液、0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)2 mL，0.025 mol·L-1的邻苯二酚溶液(用pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液配置)1 mL。25 ℃孵育5 min后，迅速放入分光光度计中，在360～500 nm进行光谱扫描，确定最大吸收波长λmax=408 nm[7]。

2.4 酪氨酸酶活性的测定

精密量取0.1 mL酶液，0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)2 mL于试管中，25 ℃孵育10 min，再加入0.025 mol·L-1的邻苯二酚溶液1 mL，摇匀，迅速放入分光光度计中，以0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)为参比，在λmax处进行时间扫描，时间范围0～300 s，扫描间隔为10 s，得到酶促反应的时间曲线，取0～80 s曲线的斜率计算酶活力[7]，调节酶液浓度，使每次实验酶活力值相同。

2.5 淡竹叶提取物对酪氨酸酶抑制率的测定

分别在4支试管中精密加入酶液、0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8)、蒸馏水及淡竹叶提取液，各溶液的加入量见表1。将4支试管在25 ℃孵育10 min后，分别加入0.025 mol·L-1的邻苯二酚溶液1 mL，继续在25 ℃孵育4 min，然后立即于λmax处测量其吸光度值。根据公式计算酪氨酸酶抑制率I。

I=[(Aa-Ab)-(Ac-Ad)]/(Aa-Ab)×100%

表1 酪氨酸酶抑制率实验中各种溶液的加入量 /mL

2.6 单因素试验

取粉碎过筛后的淡竹叶2.5 g，置于具塞锥形瓶中，分别采用超声时间(20，40，60，80 min)，料液比(1∶20，1∶40，1∶60)，超声功率(40，60，80，100 W)，乙醇浓度(50%，70%，90%)对淡竹叶进行提取，提取液抽滤，浓缩至无醇味，抽滤，定容至250 mL，相当于1 L溶液中含药材10 g。按2.5项下进行酪氨酸酶抑制率测定。

2.7 正交试验

根据单因素试验结果，以酪氨酸酶抑制率为指标，设计正交试验，对淡竹叶提取液的提取条件进行优化。

2.8 验证实验及阳性对照实验

照2.7项下筛选出的最佳提取工艺进行验证实验，照2.5项下的方法测定其酪氨酸酶抑制率，重复3次。同时，分别用1，3，5，7 g·L-1的维生素C(抗坏血酸)溶液代替提取液，照2.5项下的方法测定其酪氨酸酶抑制率。

2.9 不同浓度淡竹叶提取液对酪氨酸酶抑制作用的考察

照2.7项下筛选出的最佳提取工艺进行实验，将得到的淡竹叶提取液稀释定容，配制成1 L分别含药材2.5，5.0，7.5，10.0 g的溶液，照2.5项下的方法测定其酪氨酸酶抑制率，并求算IC50值。

3 结果

3.1 酪氨酸酶活性的测定结果

酪氨酸酶酶促反应的时间曲线见图1。可以看出，酪氨酸酶溶液的吸光度在0～80 s与时间之间呈良好的线性关系。若定义在该反应体系内以每分钟变化0.01A为一个活力单位(U)[3]，计算得出酶活力为12.9 U·min-1，表明该酶液有一定的酪氨酸酶活性，可以用于实验。

图1 酪氨酸酶酶促反应的时间曲线

3.2 单因素试验结果

3.2.1 超声时间对酪氨酸酶抑制率的影响 超声时间为20，40，60，80 min时，酪氨酸酶抑制率分别为41.7%，67.0%，54.8%，49.6%，故最佳超声时间为40 min。

3.2.2 料液比对酪氨酸酶抑制率的影响 料液比为1∶20，1∶40，1∶60时，酪氨酸酶抑制率分别为66.7%，67.1%，71.4%，由于抑制率相差不大，考虑到抽滤时料液比为1∶20时溶剂残留、1∶60时溶剂用量过大等问题，选取1∶40为最佳料液比。

3.2.3 超声功率对酪氨酸酶抑制率的影响 超声功率为40，60，80，100 W时，酪氨酸酶抑制率分别为65.1%，68.0%，74.0%，73.2%，故最佳超声功率应选择80 W。

3.2.4 乙醇浓度对酪氨酸酶抑制率的影响 乙醇浓度为50%，70%，90%时，酪氨酸酶抑制率分别为66.5%，76.8%，52.1%，故最佳乙醇浓度为70%。

3.3 正交试验结果

由单因素试验结果可知，与其他因素相比，料液比对酪氨酸酶抑制率影响较小，故以超声时间、超声功率及乙醇浓度3个因素进行L9(34)正交试验，正交试验因素和水平见表2，正交试验设计及结果见表3。

表2 淡竹叶超声提取正交试验因素水平表

表3 淡竹叶超声提取正交试验设计及结果

由表3极差数据可知，对提取物中酪氨酸酶抑制率影响的主次顺序为B>C>A，最佳提取条件为A3B3C1，即超声50 min，超声功率90 W，乙醇浓度60%。

3.4 验证实验及阳性对照实验结果

3组验证实验的酪氨酸酶抑制率结果分别为78.0%，77.1%，77.7%，平均值为77.6%，高于正交试验中各项结果，因此确定A3B3C1为最佳提取条件。阳性对照实验中3 g·L-1的维生素C溶液对酪氨酸酶的抑制率为74.3%，与验证实验中淡竹叶提取物对酪氨酸酶的抑制率相当。

3.5 不同质量浓度的淡竹叶提取液对酪氨酸酶的抑制结果

由图2可以看出，对酪氨酸酶的抑制效果，随淡竹叶提取液质量浓度的增大而线性增加，由图可计算得到IC50值为6.27 g·L-1。

图2 不同质量浓度的淡竹叶提取液对酪氨酸酶的抑制结果

4 讨论

酪氨酸酶抑制剂在化妆品、医药、食品及农业抗虫等方面均有广泛应用，近年来从天然植物中寻找安全高效的酪氨酸酶抑制剂越来越受到人们的重视。本文以酪氨酸酶抑制率为指标，对中药淡竹叶的超声提取工艺进行优选，得到其最佳提取条件为60%乙醇，超声功率为90 W，超声50 min。在此条件下，10 g·L-1的淡竹叶提取液对酪氨酸酶抑制率可达到78%。与3 g·L-1的维生素C溶液对酪氨酸酶的抑制效果相当，说明淡竹叶提取液具有较好的酪氨酸酶抑制能力。

酪氨酸酶是人体合成黑色素的关键酶，适当抑制酪氨酸酶活性可实现健康美白。淡竹叶提取液对酪氨酸酶的抑制效果在0～10 g·L-1随质量浓度的增加而线性增强，因此可通过调节提取液浓度，得到相应的抑制效果。淡竹叶提取液来源广泛，提取简便，经济有效，可为开发植物源酪氨酸酶抑制剂提供选择。

[1] 李志洲.淡竹叶总黄酮最佳萃取工艺及抗氧化性的研究[J].食品研究与开发，2008，29(11)：42-45.

[2] 傅博强，李欢，王小如，等.甘草黄酮类化合物对酪氨酸酶单酚酶的抑制[J].天然产物研究与开发，2005，17(4)：391-395.

[3] 鲁卫斌.酪氨酸酶的提取及其参与的羊毛抗菌整理[D].无锡：江南大学，2009.

[4] 邹先伟，蒋志胜.植物源酪氨酸酶抑制剂研究进展[J].中草药，2004，35(6)：702-705.

[5] 陈清西，林建峰，宋康康.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].厦门大学学报，2007，46(2)：274-281.

[6] 樊倩，韦庆义，袁尔东，等.植物中酪氨酸酶及不同抑制剂对其活性的影响[J].食品工业科技，2012，33(10)：91-93.

[7] 黄浩，彭玲，刘临，等.中药白芨提取物对酪氨酸酶的抑制作用[J].日用品工业，2008，38(6)：374-377.

InhibitionEffectofLophatherumgracileBrongnExtractsonTyrosinase

QIMeina1*，LINBing1，2，3*，YANGHang1，QIDengxiang1,ZHOULiqing1

(1.PharmacyDepartment，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.EngineeringCenterforInnovativeTraditionalChineseMedicineandEthnicMedicineofGuizhouProvince，Guiyang550025，China；3.ResearchandDevelopmentCenterofTraditionalChineseMedicinalandNaturalProducts，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Objective：The inhibitory activity of theLophatherumgracileBrongn extracts against tyrosinase was investigated in the present work.MethodsThe extract technology ofL.gracilewas optimized by orthogonal experiment.The inhibitory activity of the extracts against tyrosinase was used as evaluating criterion.ResultsThe optimum extraction conditions were obtained as follows：ultrasonic power 90W，solvent of 60% ethanol and extracting 20 min.Under these conditions，the inhibition on effect of the extract obtained from extraction(containing 10 g·L-1)achieves inhibiti on rate of 78% and IC50of 6.27 g·L-1.ConclusionBecause of the wide source and high quality in effective extraction, it can provide a new reference for resource development ofL.gracile.

LophatherumgracileBrongn extract；tyrosinase；inhibitory action；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.014

2013-11-17)