土壤无机元素对当归品质的影响△

王增绘，李文涛，黄林芳

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

专 题

国家自然科学基金(81274013)；国家自然科学基金重点项目(81130069)；人事部留学人员择优资助项目(2009-2011)；国家重大科技专项创制新药(2011ZX09307-002-01)

*

黄林芳，副研究员，研究方向：中药资源质量与评价；Tel：(010)57833197，E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

土壤无机元素对当归品质的影响△

王增绘，李文涛，黄林芳*

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的探讨当归品质与土壤中无机元素的关系。方法UPLC-PDA法测定甘肃、云南、四川和湖北4个主产区当归药材中阿魏酸、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、藁本内酯和丁烯基苯酞含量。ICP法测定土壤中和药材中16种无机元素。采用相关分析、主成分分析(PCA)及单因素方差分析方法分析探究药材道地性与土壤中及药材中无机元素之间的关联。结果土壤无机元素对当归品质有一定影响；不同产区土壤无机元素含量有差异。甘肃产当归药材中重金属Cd与Pb含量显著低于其他3个产地。As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影响药材中5种主要成分含量相关的元素，Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。甘肃和云南产当归主要活性成分含量相近，且高于湖北和四川。湖北和四川产当归主要活性成分含量相似。结论甘肃与云南产当归品质最优、四川和湖北产当归质量差于甘肃和云南产当归，体现了甘肃产当归药材的道地性。

当归；土壤；无机元素；统计学分析；化学成分；品质

当归药材为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，是临床上常用中药。当归中主要化学成分有内酯类、生物碱类、有机酸类、酚类以及挥发油类等[2-4]。2010年版《中国药典》将阿魏酸和藁本内酯作为当归质量控制的标准。已有研究表明土壤中无机元素的含量影响当归药材的道地性[5-6]。当归化学成分与当归无机元素相关性的研究较少。本文测定当归药材中阿魏酸、藁本内酸、丁烯基苯酞、洋川芎内酯A、正丁基苯酞5种主要的化学成分、药材中无机元素以及相应药材生长地土壤中化学元素的含量。利用统计学中的相关分析、主成分分析的方法对三者之间的关系进行系统分析。探究了当归药材、土壤中无机元素含量特征以及药材和土壤中无机元素与5种主要化学成分之间的关系，为无机元素对当归药材品质的影响以及当归药材道地性的评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源

当归样品材料，见表1。土壤材料在当归药材采集的同时，刮取对应根上的土壤封装于自封袋中。所采集的药材样品由中国医学科学院药用植物研究所标本馆林余霖研究员，鉴定为伞形科植物当归Angelica.sinensis(Oliv.)Diels。

表1 不同产地当归样品

1.2 材料处理

新鲜的当归药材根，用自来水清洗至表面无土，蒸馏水冲洗3遍后，再用去离子水冲洗3遍。冲洗好的样品放置在托盘中，室温自然晾干。药材粉碎，过60目筛，粉末放置于锥形瓶中备用。取部分粉末于研钵中，继续研磨，过80目筛放置自封袋中封存，供药材中无机元素含量测定。土壤样品放置在干净的玻璃培养皿中，室内自然晾干后，置研钵中研碎，过100目筛，置自封袋中封存，供无机元素测定使用。

1.3 分析方法

1.3.1 当归中5种主要化学成分提取和UPLC-PDA分析

取药材粉末约0.2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。进液相前用0.22 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液备用。分别精密称取阿魏酸(ferulic acid，1)，洋川芎内酯A(senkyunolide A，2)，正丁基苯酞(n-butylphthalide，3)，藁本内酯(ligustilide，4)，丁烯基苯酞(butylidenephthalide，5)各1.00 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，振摇使混合均匀，配制成混合对照品储备液，备用。Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪-(PDA)二极管阵列检测器。色谱柱：BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 um)；柱温：35 ℃，样品室温度4 ℃，流速：0.3 mL·min-1，提取检测波长：261 nm，流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱，0～4 min：5% B；4～7 min：5%-24% B；7～8 min：24%-28% B；8～10 min：28%-50% B；10～12 min：50%～70% B；12～14 min：70～100% B。

1.3.1.1 方法学考察

1.3.1.1.1 线性关系 分别精密吸取混合对照品储备液100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000 μL至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样量2 μL，按上述色谱条件进行UPLC-PDA分析测定。以各标品浓度数值为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得到各线性回归方程。最小检测限(LOD)和最小定量限(LOQ)定义为信噪比分别等于3(S/N=3)和10(S/N=10)时样品浓度(见表2)。

1.3.1.1.2 重现性实验 取同一批次的甘肃岷县当归样品DG1，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，各对照品色谱峰的峰面积在0.61～2.89%范围内，表明此方法的重现性良好。

1.3.1.1.3 精密度 取DG1样品重复进样6次，每次2 μL，测得各峰保留时间(RT)和峰积分面积(PA)。并计算RSD值，5个主要成分保留时间和峰面积RSD分别在0.24%～0.72%和1.07%～3.43%范围内。

表2 阿魏酸及苯酞类成分的标准曲线方程及最低检测限、定量限

1.3.1.1.4 稳定性实验 取上述供试品溶液，放置0、2、4、8、12、24、36 h后分别测定和记录峰积分面积，样品浓度的RSD值在0.76%～2.25%范围内，表明样品在36 h内稳定。

1.3.1.1.5 加样回收率实验 取已测知含量的同一批次(甘肃岷县-DG1)样品6 份，每份约0.2 g，精密称定，分别精密加入一定量(相当于样品中的量)5种对照品，按供试品溶液的制备方法操作，按上述色谱条件测定。5种成分的回收率在98.33%～102.22%，RSD值在1.16%～4.72%之间。

1.3.1.2 样品测定

提取处理好的供试品样品溶液，直接进UPLC-PDA分析，单个样品重复进3次，得到数据取平均值。

1.3.2 当归药材和土壤中无机元素的测定

参考JY/T 015-1996感偶合等离子体发射光谱方法通则标准，对药材中和土壤中无机元素测定。精密称量样品1 g至石英消解管中，加入硝酸与盐酸的混酸约4 mL，置于石墨加热炉上，60 ℃消解12 h，然后提高到120 ℃赶酸2 h，定容到25 mL，取约20 mL溶液0.22 μm滤膜，进ICP(电感偶合等离子体发射光谱仪)分析。单个样品测定3次，取平均值。

1.3.3 数据分析

应用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析、简单相关分析；应用The Unscrambler 9.0软件进行主成分分析。

2 结果

2.1 差异比较

2.1.1四地当归主要化学成分差异 甘肃岷县和云南鹤庆县产当归在5种主成分含量累积总量上明显高于湖北房县和四川中江县，其中正丁基苯酞的含量在四地产当归中含量差异相对其余4种成分差异较小(P=0.036，其余4种成分P<0.001为极显著差异)较小，其余4种成分中甘肃岷县和云南鹤庆县的都明显高于四川中江县和湖北房县(见图1)。甘肃岷县、云南鹤庆县、四川中江县和湖北房县产当归中阿魏酸含量的算术平均值为0.096%、0.141%、0.015%、0.005%；四地产当归阿魏酸最大值分别为0.119%、0.150%、0.019%、0.060%，最小值为0.062%、0.136%、0.013%、0.005%。标准差分别为0.249、0.070、0.036、0.005；单因素方差分析表明，云南鹤庆县当归和甘肃岷县当归的阿魏酸含量高于湖北房县和四川中江县产当归。阿魏酸作为当归药材质量控制的标准之一，2010年版《中国药典》规定HPLC测定法其含量不少于0.05%。从四地当归中阿魏酸的含量分析，可以看出甘肃岷县和云南鹤庆县当归中阿魏酸含量都高于药典标准，而湖北房县和四川中江县产当归中阿魏酸含量则远低于药典标准，表明甘肃岷县和云南鹤庆县的当归药材合格。

四地产当归5种成分PCA分析结果表明甘肃岷县和云南鹤县当归差异较小，score plot结果显示甘肃岷县和云南鹤庆县相距较近、湖北房县和四川中江县相距较近。Loading plot结果初步表明引起甘肃岷县当归、云南鹤庆县当归与湖北房县和四川中江县当归差异的因子为阿魏酸、藁本内酯和丁烯基苯酞(见图2)，与上述单因素方差分析结果显示一致。

2.1.2 四地当归药材中无机元素差异 单因素方差分析结果显示，Cd(P<0.001)、Ca与Ba元素在四地有显著的差异P<0.01，Al与Pb元素在四地有显著性差异P<0.05。其中当归中Cd含量：湖北房县>云南鹤庆县>四川中江县>甘肃岷县，Pb含量：湖北房县>四川中江县>云南鹤庆县>甘肃岷县，Ca含量：甘肃岷县>云南鹤庆县>湖北房县>四川中江县，Ba含量:湖北房县>四川中江县>甘肃岷县>云南鹤庆县，Al含量：云南鹤庆县>四川中江县>湖北房县>甘肃岷县。

通过对四地产当归中无机元素进行PCA分析，score plot结果发现4个产地表现出一定差异，但是湖北房县、四川中江县和云南鹤庆县3个产地有交叉，不能通过无机元素分析很好的将4个产地区分开(见图3)。

图1 四个产地当归药材中5种化学成分含量

图2 当归药材不同产地化学成分PCA分析

图3 四个产地当归药材中无机元素PCA分析

2.1.3 四地土壤中无机元素含量差异

单因素方差结果分析显示，四地当归生长的土壤中大多数的无机元素为显著差异和极显著差异。Na和Ba元素在四地当归中无显著差异P>0.05，Cd和Pb元素表现显著差异，其余的元素表现极显著差异P<0.001。

通过对四地当归生长地土壤无机元素PCA分析，score plot 结果表明4个产地表现出较明显的差异(见图4)。loading plot图表明引起差异的因素，根据单因素分析结果大多数的元素含量有显著或极显著的差异，因而大多数的元素都是导致四地土壤性质明显差异的因素。

图4 当归四个不同产地土壤中有机元素PCA分析

2.2 相关性分析

2.2.1 当归主要化学成分与无机元素相关分析 当归中阿魏酸与As、Mn元素呈现显著正相关关系(P<0.05)；Ba元素与阿魏酸含量呈显著负相关(P<0.01)；洋川芎内酯A与Mn元素呈显著性正相关(P<0.01)，As、Ni元素与洋川芎内酯A呈显著性正相关(P<0.05)；正丁基苯酞与Ca元素呈显著性正相关(P<0.01)；藁本内酯、丁烯基苯酞与As和Mn元素呈显著性正相关(P<0.05)，Pb元素与藁本内酯和丁烯基苯酞呈显著性负相关(P<0.05)，Ba元素与藁本内酯和丁烯基苯酞呈显著性负相关(P<0.01)(见表3)。

2.2.2 当归中无机元素之间的相关性 Fe元素与Pb、Mn、Ni(P<0.05)和As、Al元素(P<0.01)呈显著性正相关；Al元素与As、Cd、Ni、Ba(P<0.05)Pb以及Fe元素(P<0.01)呈显著性正相关；Cd元素与Ca元素(P<0.05)呈显著性负相关，与Pb、Al、Na(P<0.05)和Ni元素(P<0.01)呈显著性正相关。As元素与Mn、Fe(P<0.01)和Al元素(P<0.05)呈显著性正相关，B元素与Na(P<0.01)和Ba元素(P<0.05)呈显著性正相关(见表3)。

表3 当归药材无机元素与化学成分之间相关性分析

注：*P0.05水平**P0.01水平,下同

2.2.3 土壤中无机元素与当归中无机元素之间的相关性 药材中Mn、Mg(P<0.01)、 Ca(P<0.05)3种元素的含量与土壤中该3种元素的含量呈显著正相关。其中Mn元素与Cu、Fe、Ba、Al和Ni元素(P<0.05)元素呈显著正相关；Ca元素与Cd、Cu、Zn、Mn元素(P<0.05)、Sn、Al元素和Cr元素(P<0.01)呈显著性正相关；As元素与Cu、Zn、Fe、B、Ni元素(P<0.01)、Cr、Al元素和Mn(P<0.05)元素呈显著性正相关；Pb元素与As、Ca(P<0.05)元素呈显著性负相关；Cd元素与Ca、Mg元素(P<0.01)呈显著性负相关(见表4)。

2.3 富集系数

药材中元素含量总和与该元素在土壤中含量总和之比为富集系数。由当归药材富集系数可以看出，当归只对Na元素表现出富集作用(见表5)。

表4 当归药材中无机元素与土壤中无机元素相关性分析

表5 当归对无机元素的富集系数

3 讨论

3.1 当归药材中5种化学成分含量评价

传统研究观点认为甘肃岷县为当归药材的道地产区[7-9]。结合5种化合物含量分析和PCA分析，四地当归5种主成分含量的差异分析结果支持了甘肃岷县为当归药材道地产区的观点。

3.2 当归药材中无机元素特征

《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》(WMPT2-2004)中的药材重金属限量指标。As、Pb和Cd元素为有害人体健康金属元素，本次所有当归样品中含量都低于该标准，从以上分析结果显示甘肃岷县产当归药材中这两种金属元素含量都是最低，符合绿色食品的理念和道地药材的质量标准，支持甘肃岷县产当归是道地药材的观点。

3.3土壤中无机元素评价

依据《土壤环境质量标准》(GB15618-1995)，四地地土壤中Cd、Pb、Cr、Ni、Cu、Zn元素含量达到一级土壤环境质量标准值，因此4个产地的土壤都达到了国家一级标准。《国家中药材生产质量管理规范》(GAP)中规定中药材产地的土壤应符合土壤质量二级标准，故四地土壤均合格。

3.4 土壤中无机元素对药材中无机元素和药材中化学成分的影响

相关性分析结果表明，不同当归样品中的多数有相关的元素之间都呈现正相关关系，大多数有正相关关系的元素在植物吸收的过程中可能具有协同的作用，Cd和Ca元素呈显著性负相关，推测Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。Mn、Ca和As 3种元素在药材中的含量与在土壤中含量呈正相关，并且这3种元素与5种主要的成分间呈显著性正相关；同时Ni元素在药材中与Mn、As元素呈显著正相关，因此我们认为Mn、Ca、As和Ni 4种元素对当归药材质量影响比较大。因此As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影响药材中5种主要成分含量相关的元素。

本研究从有害金属元素在土壤和药材中含量差异、主成分含量差异以及土壤中无机元素与药材中无机元素的差异和相关性等方面进行研究，得出的结果支撑了甘肃岷县产当归为道地产区药材的论点。土壤系统为一个极为复杂的系统，药材根际土壤中元素对药材中成分的含量影响还需要更直接的实验验证，本研究为进一步深入研究提供了一定的参考。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 王芳，李东.当归的化学及药理研究进展[J].中国药房，2003，14(10)：630-631.

[3] 杨帆，肖远胜，章飞芳.当归化学成分HPLC-MS/MS分析[J].药学学报，2006，41(11)：1078-1083.

[4] Lu X，Zhang J，Liang H，et al.Chemical constituents ofAngelicasinensis[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2004，13(1)：1-3.

[5] 宋平顺，张明童，王捷，等.土壤中的无机元素对当归药材道地性的影响[J].甘肃岷县农业大学学报，2013，1：018.

[6] 严辉，段金廒，钱大玮，等.不同产地当归药材及其土壤无机元素的关联分析与探讨[J].中药材，2011，34(4)：512-516.

[7] 孙红梅，张本刚.甘肃地区当归生长动态调查[J].中国农学通报，2010，26(17)：386-389.

[8] 孙红梅，张本刚，齐耀东，等.当归药材资源调查与分析[J].中国农学通报，2009，25(23)：437-441.

[9] 金世元.论道地药材[J].中药研究与信息，2001，3(11)：11-12.

EffectsofInorganicElementsinSoilonAngelicasinensisQuality

WANGZenghui,LIWentao，HUANGLinfang*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100093,China)

Objective：To investgate relationshi Pbetween the content of inorganic elements in soil and the quality ofAngelicasinensis.MethodsA total of 15 samples were analyzed.UPLC-PDA was used to determine the content of ferulic acid，senkyunolide A，n-Butylphthalide，ligustilide，butylidenephthalide inA.sinensis.The inorganic elements were determined by IC Pmethod.PCA method was used to discriminate different Angelica samples.One-way ANOVA and correlation analysis was used to find the relationshi Pamong the samples.ResultsThe differences of inorganic elements content inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan are greater than that from Hubei and Sihcuan.The total content of five chemical components inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were higher than that from Hubei and Sichuan.The contents of Cd and Pb in Gansu were lower than that in the other three places.ConclusionThe quality ofA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were much better than that from Hubei and Sichuan which support that，A.sinensisin Gansu is the genuine medicinal materials.

Angelicasinensis；Soil；Inorganic elements；Chemometrics；Chemical components； Quanlity

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.001

2013-10-23)