双黄痛风胶囊质量标准提高研究

陈玉棠，黄艺蓉，成金乐，梁燕玲，陈金梅

(1.广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006； 2.中山市中智药业集团有限公司，广东 中山 528437)

双黄痛风胶囊质量标准提高研究

陈玉棠1，2，黄艺蓉1，2，成金乐2*，梁燕玲2，陈金梅2

(1.广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006； 2.中山市中智药业集团有限公司，广东 中山 528437)

目的补充优化双黄痛风胶囊的薄层鉴别及含量测定方法，提高其质量标准。方法采用薄层色谱法(TLC)对处方中赤芍、黄芪、秦皮进行定性鉴别；用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定黄芪甲苷的含量。色谱条件：Agilent Zobax C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-水(32∶68)；蒸发光散射检测器(ELSD)。结果薄层鉴别方法专属性强；HPLC法测得黄芪甲苷在1.123～6.741 μg(r=0.999 9)线性关系良好，平均回收率为99.75%，RSD=1.75%。结论提高后的标准方法简便可行，专属性强，重复性好，可更好地控制双黄痛风胶囊的质量。

双黄痛风胶囊；薄层色谱法；高效液相色谱-蒸发光散射检测法；黄芪甲苷；质量标准

双黄痛风胶囊是正在研制开发的中药第6类新药，由黄芪、秦皮、赤芍、黄柏、茶叶组成，具有益气活血、清热利湿的功效，用于气虚血瘀兼湿毒瘀阻型高尿酸血症。黄芪甲苷为本方君药黄芪的主要活性成分，具有抗心力衰竭、保护心血管、降压、镇痛、调节血液尿酸代谢等作用[1-2]。双黄痛风胶囊原质量标准草案中，鉴别项仅对茶叶所含的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)进行薄层鉴别，未对处方中其他药味进行鉴别；含量测定项对黄芪甲苷的检测采用操作繁杂、重复性较差的薄层色谱扫描法，结果准确度不高。实验通过研究，在双黄痛风胶囊原标准的基础上，增加了对赤芍、黄芪和秦皮的薄层色谱鉴别，并改用HPLC方法对黄芪甲苷进行含量测定，提高了双黄痛风胶囊的质量标准，可更好地控制产品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪(G4218A的ELSD蒸发光检测器)；Agilent Chemstation色谱工作站；AUW220D十万分之一电子天平(岛津公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)；DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);KQ-400KOE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

黄芪甲苷(批号：110781-200613)、芍药苷(批号：110736-201136)、秦皮甲素(批号：110740-200104)、秦皮乙素(批号：110741-200506)、黄芪对照药材(批号：120974-201110)、赤芍对照药材(批号：121093-200402)、秦皮对照药材(批号：121415-200702),均购自中国食品药品检定研究院；双黄痛风胶囊(批号：110801，210301，310301)、阴性对照品由中山市中智药业集团有限公司提供；乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 赤芍[3]

2.1.1.1 供试品溶液的制备 取本品内容物约3 g，置具塞锥形瓶中，加50%乙醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解；用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次20 mL，弃去氨液，取正丁醇液30 mL水浴蒸干(剩余30 mL，用于黄芪薄层鉴别供试品的制备)，残渣加乙醇1 mL使溶解，即可。

2.1.1.2 对照品溶液的制备 另取芍药苷对照品适量，加乙醇制成2 mg·mL-1的对照品溶液。

2.1.1.3 对照药材溶液的制备 取赤芍对照药材0.5 g，加乙醇10 mL，振摇5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，即可。

2.1.1.4 阴性样品溶液的制备 取不含赤芍的阴性样品，按“供试品溶液制备方法”制成阴性样品溶液。

2.1.1.5 TLC鉴别 按照薄层色谱法[4]，吸取上述4种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，见图1。

1.芍药苷对照品 2.赤芍对照药材 3.缺赤芍阴性样品 4～6.供试品(批号：110801，210301，310301)图1 双黄痛风胶囊中赤芍TLC图

2.1.2 黄芪[4，5]

2.1.2.1 供试品溶液的制备 取2.1.1赤芍供试品溶液制备项下剩余的30 mL正丁醇液，蒸干；残渣加水5 mL微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5 cm，柱高为12 cm)依次以50 mL水、30 mL40%乙醇、50 mL 70%乙醇洗脱，收集70%乙醇的洗脱液，蒸干；用甲醇溶解并转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即可。

2.1.2.2对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制得1 mg·mL-1的黄芪甲苷对照品溶液，置于4 ℃保存。

2.1.2.3 对照药材溶液的制备 取黄芪对照药材1 g，加甲醇20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100～120目，5 g，内径10～15 mm)上，用40%甲醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干；残渣加水30 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液；用水萃取2次，每次20 mL；弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即可。

2.1.2.4 阴性样品溶液 取不含黄芪的阴性样品，按2.1.2.1项下供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.1.2.5 TLC鉴别 按照薄层色谱法[4]，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10 ℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

1.黄芪甲苷对照品 2.黄芪对照药材；3.缺黄芪阴性样品 4～6.供试品(批号：110801，210301，310301)图2 双黄痛风胶囊中黄芪TLC图

2.1.3 秦皮

2.1.3.1供试品溶液的制备 取本品内容物约3 g，置具塞锥形瓶中，加乙醇40 mL，加热回流2次，每次30 min，滤过，滤液浓缩至稠膏，加水20 mL溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯层，浓缩至稠膏。浓缩液加乙醇5 mL溶解，加到聚酰胺柱(内径10～15 mm，柱高15 cm)，水洗脱至无颜色，蒸干。用乙醇溶解定容到2 mL量瓶中。

2.1.3.2 对照品溶液制备 取秦皮甲素对照品和秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液。

2.1.3.3 对照药材溶液的制备 取秦皮对照药材1 g，加甲醇10 mL，加热回流10 min，放冷，滤过，取滤液。

2.1.3.4 阴性样品溶液制备 取不含秦皮的阴性样品，按2.1.3.1项下供试品溶液制备方法制备。

2.1.3.5 TLC鉴别 按照薄层色谱法[4](《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述8种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(10∶2.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品无干扰。

1.秦皮甲素对照品 2.秦皮乙素对照品 3.混合对照品 4.缺秦皮阴性样品 5.秦皮对照药材 6～8.供试品(批号：110801，210301，310301)图3 双黄痛风胶囊中秦皮TLC图

2.2 黄芪甲苷的含量测定[6-9]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zobax C18(250 mm×4.6mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(32∶68)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；ELSD蒸发光散射检测器参数：漂移管温度40 ℃，载气(氮气)压力3.5 Bar。理论板数按黄芪甲苷峰计算不低于4 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.1 mg·mL-1的对照品溶液，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下本品内容物研细，取约0.75 g，精密称定，精密移取80%甲醇50 mL于具塞锥形瓶中，称定；超声处理45 min(功率320 W，频率4 kHz)，放冷，用甲醇补足损失量，滤过，滤液蒸干。残渣加水15 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液；用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液；正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 取缺黄芪的阴性对照样品，照2.2.3项下供试品溶液的制备制成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性试验 精密吸取上述3种溶液各20 μL，分别注入色谱仪，按其色谱条件测定，结果见图3。供试品溶液和对照品溶液在相应保留时间出现相似峰，分离度良好，而阴性样品溶液在黄芪甲苷色谱峰相应的保留时间处无干扰，黄芪甲苷峰与其他组分达到基线分离。

A.黄芪甲苷对照品 B.供试品 C.缺黄芪阴性样品图3 双黄痛风胶囊及对照品HPLC图

2.2.6 线性关系考察 分别精密移取黄芪甲苷对照品溶液(0.5 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，分别吸取续滤液20 μL注入液相色谱仪测定，以进样量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=1.611 3X+5.094 5，r=0.999 9。黄芪甲苷在1.123～6.741 μg与峰面积对数值呈良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液20 μL，重复进样6次，依法测得黄芪甲苷峰面积对数的RSD=0.01%，说明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下放置，分别在0，2，4，6，8，10，24 h依法测定，得黄芪甲苷峰面积对数的RSD=0.13%(n=7)，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 分别取同一批样品(批号：310301)5份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，依法测定，结果黄芪甲苷含量的RSD=0.03%，表明方法重现性好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品(批号：310301)6份，每份约1 g，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(即0.5 mg·mL-1)0.8，0.9，1.0 mL，按2.2.3项下方法配制供试品溶液，依法测定，进样量为20 μL，记录色谱峰，计算回收率及其RSD值，见表1。

表1 双黄痛风胶囊中黄芪甲苷加样回收率试验

2.2.11 样品含量测定 分别取不同批号样品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，每批取3份，依法测定，结果见表2。

表2 双黄痛风胶囊中黄芪甲苷含量测定

2.2.12 最低检测限试验 精密移取黄芪甲苷对照品溶液(1.123 mg·mL-1)1 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取3 μL，注入高效液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件测定，采用信噪比法，测得色谱图中信噪比为3.2，因此黄芪甲苷的检测限为168 ng。

3 讨论

在赤芍的薄层鉴别中，本法制备的供试品溶液，所得的薄层色谱背景杂质干扰小，斑点清晰。同时，该供试品溶液制备方法亦用作黄芪薄层鉴别项供试品前处理的制备，可大大简化操作步骤，提高实验效率。本实验也考察了乙酸乙酯-冰醋酸-水(8∶2∶1)[10]、三氯甲烷-甲醇(5∶1)[11]等不同的展开剂系统，但展开效果不佳，而本文采用的展开系统分离效果好、斑点清晰。

秦皮的薄层鉴别中，曾参考《中国药典》2010年版秦皮药材的供试品制备方法，但受到其他物质的严重干扰，无法显现斑点，经过摸索，本实验的方法经提取纯化后能排除杂质的干扰，更适合本制剂的薄层鉴别。同时也考察不同展开系统，结果存在阴性干扰或与对照品色谱相应的位置上，未显相同颜色的斑点。本展开系统是根据《中国药典》方法通过调整得出的，斑点分离得好，不受杂质干扰。

在黄芪甲苷的含量测定项中，供试品溶液的制备分别考察了不同提取方法(索氏提取和超声提取方法)、不同提取溶剂(水、50%甲醇、80%甲醇、2%氢氧化钾甲醇溶液)对黄芪甲苷含量的影响，结果表明以80%甲醇作溶媒超声提取效果最佳，而2%氢氧化钾甲醇溶液提取黄芪甲苷含量虽高，但长时间处在碱性条件下，可能会导致成分发生变化，故不选用。本实验还考察了不同提取时间(30，45，60 min)和不同纯化方法(过大孔树脂柱和不过树脂柱)对黄芪甲苷含量影响，结果超声45 min和不过大孔树脂柱方法的效果为佳。

实验选用ELSD检测器，能克服DAD检测器对皂苷类成分紫外末端吸收弱的缺点，更好地用于皂苷类成分的检测。

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StudiesonImprovingQualityStandardofShuanghuangTongfengCapsules

CHENYutang1，2，HUANGYirong1，2，CHENGJinle2*，LIANGYanling2，CHENJinmei2

(1.ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering，GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan(GuangzhouUniversityofChineseMedicine)，MinistryofEducation，Guangzhou510006，China； 2.ZhongshanZeusPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Zhongshan528437，China))

Objective：To impove the quality standard of Shuanghuang Tongfeng Capsules.MethodsThe TLC method was used to identifyPaenoiaeRadixRubra，AstragaliRadixandFraxiniCortex.The study of HPLC-ELSD methodology was carried out to determine the content of Astragaloside Ⅳ in the capsules.Chromatography method was performed on an Agilent Zobax ODS column(250 mm×4.6 mm，5 μm)，the mobile phase composition was acetonitrile-water(32∶68).ResultsThis method is good in separation，strong in specificity.The linear range of Astrogaloside Ⅳ was 1.123-6.741 μg(r=0.999 9).The average recovery rate was 99.75%，RSD1.75%.ConclusionThe method is simple，feasible and reproducible.It can be used for the quality control of Shuanghuang Tongfeng Capsules.

Shuanghuang Tongfeng Capsules；TLC；HPLC-ELSD；Astrogaloside Ⅳ；Quality

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成金乐，主任中药师，研究方向：创新中药开发；Tel：(0760)85312928，E-mail：gdcjl9@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.015

2013-09-12)

standard