酸性染料比色法测定不同种质槟榔总生物碱的含量△

杨新全，何明军，卢丽兰*，侯明

(1.中国医学科学院 药用植物研究所 海南分所，海南 万宁 571533； 2.海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 万宁 571533)

酸性染料比色法测定不同种质槟榔总生物碱的含量△

杨新全1，2，何明军1，2，卢丽兰1，2*，侯明1，2

(1.中国医学科学院 药用植物研究所 海南分所，海南 万宁 571533； 2.海南省南药资源保护与开发重点实验室，海南 万宁 571533)

目的建立一种简便且准确测定槟榔中总生物碱含量的方法。方法以氢溴酸槟榔碱为对照品，采用酸性染料比色法测定总生物碱的含量，测定波长为618 nm。结果槟榔总生物碱在20～120 μg呈线性关系，回归方程为Y=4.226 7X-0.005 2(r=0.999 6)，平均回收率为99.6%，RSD=1.54%。稳定性、精密度和重复性都比较高，RSD分别为1.32%，0.109%，2.18%。样品分析结果为红心槟榔含量最高，常见槟榔含量次之，西瓜槟榔较低。结论该方法操作简便、灵敏、准确，可用于槟榔总生物碱的质量控制。

酸性染料比色法；槟榔；总生物碱

槟榔是棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.的干燥成熟种子，原产于马来西亚，在我国主产于海南、台湾、云南河口及西双版纳热带雨林间，广西、广东及福建仅有少量分布[1]。槟榔作为我国著名四大南药之首，是一种常用中药，其主要成分是生物碱。据目前分析测定，槟榔含生物碱0.3%～0.6%，主要为槟榔碱，含量为0.1%～0.5%；其余为槟榔次碱、去甲基槟榔次碱、去甲基槟榔碱、槟榔副碱和高槟榔碱等，它们均与鞣酸结合而存在[2]。由于生物碱呈一定程度的碱性，所以槟榔碱在植物体组织和器官中常与酸性物质结合成盐存在，而真正呈游离状态的槟榔碱极其少。

槟榔具有杀虫，消积，行气，利水，截疟功能[5]，可作强壮剂、消化剂、收敛剂、抗虐剂、消肿剂、镇咳剂和痛经剂，也与其他药物配成利尿和治疗腹泻、食滞、脘腹胀痛、水肿、腰痛、高山热、支气管炎的药丸，也是防治蛔虫、姜片虫及家畜胃寄生虫的特效药[3-4]。关于槟榔中生物碱的测定方法，有滴定法[5-6]、薄层扫描法[7]、阳离子交换色谱法[8]和反相高效液相色谱法[9-10]等，这些方法或操作繁琐，或对仪器要求较高。生物碱盐与酸性染料形成离子对，可被三氯甲烷定量提取，加入碱液后酸性染料游离出来，因此用比色法测定该有色溶液的吸光度，从而确定生物碱的含量[11]。笔者采用酸性染料比色法对海南

常见槟榔、西瓜槟榔(槟榔果表皮具斑状花纹得名)、红心槟榔(槟榔果果仁中心红色得名)等3种不同槟榔的槟榔碱含量进行对比，期望对我国现有不同种质槟榔中槟榔碱的含量差异有比较清楚的认识，从而为槟榔的标准化种植和生产奠定基础。

1 材料与仪器

UV-2450分光光度计(日本岛津公司)，雷磁pH-25酸度计(上海精宏实验设备有限公司)，KQ-500D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AL104-1C万分之一电子天平(托利多上海有限公司)，DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)。

氢溴酸槟榔碱(广州市药品检验所，批号：300-08-3，经GC测定含量达98.5%)；0.8 mg·mL-1的溴甲酚绿溶液、0.01 mol·L-1的氢氧化钾无水乙醇溶液均为分析纯，槟榔药材采自于海南万宁、琼中、陵水地区，供试样品为常见槟榔、西瓜槟榔、红心槟榔，性状见表1。

表1 3种槟榔样品性状

注：不同小写字母代表不同种质槟榔果实的差异程度(P<0.05)

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取氢溴酸槟榔碱125 mg，置50 mL容量瓶中，加pH=5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液溶液(由0.1 mol·L-1的醋酸钠和0.1 mol·L-1的醋酸配制而成)并稀释至刻度，得对照品贮备液。精密吸取1 mL贮备液置50 mL容量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度，得对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取槟榔粉末(事先用万能粉碎机粉碎后过3号筛而得)约1.000 0 g，置带塞磨口锥形瓶中，精密加入浓氨水6 mL浸润2 min，加乙醚30 mL超声振荡20 min，分取乙醚液，残渣加乙醚超声振荡3次，每次10 mL，各5 min，合并乙醚液，最后加入适量乙醚洗涤锥形瓶2～3次(上述实验经验证需要进行过滤操作)。50 ℃水浴蒸发至约10 mL，移置分液漏斗中，用0.01 mol·L-1硫酸溶液40 mL，分4次萃取，每次分别为15，10，10，5 mL。萃取酸水液同置50 mL容量瓶中，用1 mol·L-1醋酸钠调至 pH=5，摇匀，用pH=5.0 醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至刻度，即得供试品溶液。

2.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mL，分别置分液漏斗中，于618 nm波长处测定吸光度，以槟榔碱量为横坐标(X)，以吸光度为纵坐标(Y)作标准曲线，得回归方程：Y=4.226 7X-0.005 2(r=0.999 6)，表明槟榔碱在20～120 μg具有良好的线性关系。

2.4 稳定性试验

精密吸取常见槟榔供试品溶液1 mL，于618 nm波长处每隔10 min测定其吸光度，结果表明自测定起1 h内稳定，RSD=1.32%。1 h后吸光度有所下降，所以一定要控制测定浓度的时间。

2.5 精密度试验

取氢溴酸槟榔碱对照品溶液，连续测定6次，吸光度的RSD=0.11%，表明仪器精密度符合要求。

2.6 重复性试验

精密称取常见槟榔粉末6份，各约1.000 0 g，置带塞磨口锥形瓶中，同样品制备和测定方法项条件下操作，结果平均含量为0.502 mg·g-1，RSD=2.18%，表明样品制备和测定误差符合要求。

2.7 回收率试验

精密称取常见槟榔粉末6份，各约1.000 0 g，精密加入对照品溶液0.5 mL，同供试品制备项下操作，于618 nm处测吸光度，结果如表2所示。

表2 槟榔样品中氢溴酸槟榔碱回收率试验

注：氢溴酸槟榔碱对照品加入量均为0.120 mg

2.8 不同种质槟榔果实总生物碱含量测定

精密吸取供试品溶液1 mL置分液漏斗中，精密加入pH=5.0醋酸-醋酸钠缓冲液4 mL和溴甲酚绿溶液2 mL，轻轻摇匀。分3次萃取，分别精密加入三氯甲烷2，3，5 mL，每次振摇2 min，静置30 min，分取三氯甲烷层，置预先放有无水硫酸钠0.2 g的干燥容量瓶中，振摇，静置30 min，精密吸取上清液 5 mL，精密加入0.01 mol·L-1的氢氧化钾无水乙醇液1 mL，摇匀后于618 nm波长处测定吸光度。3种槟榔中总生物碱的含量测定结果见表3。红心槟榔总生物碱含量最高，常见槟榔含量次之，西瓜槟榔较低。

表3 不同种质槟榔果实中总生物碱的含量测定

注：小写字母a表示不同种质槟榔果实的总生物碱含量差异不具有统计学意义(P>0.05)

3 讨论

在测定最大吸收波长时，用三氯甲烷萃取液直接测定，结果在414 nm波长处离子对有最大吸收，加入0.01 mol·L-1的氢氧化钾无水乙醇溶液所游离染料在618 nm波长处有最大吸收，而且其灵敏度比前者增加1倍，空白吸收也较前者小[8]。经验证后，确实如上所述，故采用后者。

由于三氯甲烷中水分含有微量的酸性染料，影响测定结果的准确性，为了消除其影响，可采用离子对提取后静置30 min，再用无水硫酸钠脱水的方法[11]。

实验方法操作简便、灵敏、准确，可用于槟榔中生物碱的含量测定。3种不同种质槟榔果实中总生物碱分析结果表明，红心槟榔含量最高，常见槟榔含量次之，西瓜槟榔较低。不同种质槟榔总生物碱的差异可能受到种植环境、气候等外在因素的影响，也可能来自种质遗传基因的内在因素影响。因此，从用药考虑，在今后槟榔种植中，建议优先考虑红心槟榔。

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[3] 杜道林，王小英，甘炳春，等.不同品种槟榔果实性状及其槟榔碱含量的比较研究[J].广西植物，2004，24(5)：433.

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DeterminationofTotalAlkaloidsfromDifferentArecanut(ArecacatechuLinn)GermplasmbyAcidDyeColorimetryMethod

YANG Xinquan1，2，HE Mingjun1，2，LU Lilan1，2*，HOU Ming1，2

(1.HainanBranch，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Wanning571533，China； 2.HainanProvincialKeyLaboratoryofResourcesConservationandDevelopmentofSouthernMedicine，Wanning571533，China)

Objective：To establish a simple and accurate method for the determination of total alkaloids in arecanut.MethodsThe determination was carried out by acid dye colorimetry with arecoline hydrobromide as reference，at wavelength of 618 nm on UV-2450 spectrophotometer.ResultsThe total alkaloid contents of arecanut were linear in the range of 20 to 120 μg，the regression equation wasY=4.226 7X-0.005 2 (r=0.999 6)，the average recovery was 99.6% with a RSD of 1.54%.There was a relatively high stability，precision and repeatability，RSD were 1.32%，0.109% and 2.18% respectively.The results of sample analysis showed the highest total alkaloid content was in red arecanut germplasm，followed by common arecanut germplasm，the lowest in watermelon arecanut germplasm.ConclusionThe method is simple，sensitive and accurate.

Acid dye colorimetry；ArecacatechuLinn；Total alkaloids

国家科技支撑计划——重点道地南药良种选育及规范化生产关键技术研究(2007BAI27B03)；国家科技支撑计划——白木香等7种中药材规范化种植基地及其SOP优化升级研究(2011BAI01B07)

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卢丽兰，博士，助理研究员，研究方向：土壤理化、植物营养；Email：lulilan1234@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.03.006

2013-06-25)