碳源和氮源对5-酮基-葡萄糖酸生成的影响

谭之磊，王洪翠，魏彧翘，李艳艳，钟成，贾士儒

天津科技大学生物工程学院 教育部工业发酵微生物重点实验室，天津 300457

L(+)-酒石酸是一种天然有机酸，其他旋光性酒石酸在自然界尚未被发现[1]，其盐类较稳定，应用广泛。在食品和饮料中可用作食品添加剂，如酸味剂和膨化剂，酸味值约为柠檬酸的1.3倍，而且是葡萄酒生产过程中唯一一种允许添加的酸味剂[2]，对葡萄酒的味道及口感有很重要的影响[3]；在医药方面，可作外科绷带硬化剂、药物拆分剂和酒石酸异丁嗪等药品的成盐剂[4]；在纺织工业上，用作酸性还原剂[5]。此外，还可作印染的防染剂、照相显影剂[6]以及应用于电镀、制革[7]等行业。酒石酸的生产方法主要有提取法[8]、半生物合成法[9-10]和酶法[11]，目前国内生产L(+)-酒石酸主要是采用酶法，利用微生物转化顺式环氧琥珀酸[11]的方法，能产生顺式环氧琥珀酸水解酶的菌种[12-13]有很多，其常用生产菌种主要是棒状杆菌[14]和诺卡氏菌[15]，此工艺的底物为顺式环氧琥珀酸，其来源复杂[16]，安全性低，耗能高。氧化葡萄糖杆菌[17]Gluconobacter oxydans可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并进一步氧化成 2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和 5-酮基-葡萄糖酸[9](5KGA)，其中5KGA在催化剂[10]的作用下能够转化为L(+)-酒石酸[18]，此方法改善了以上不足之处。Helmut Görisch 等[19-20]筛选出一株核黄素依赖型GA-2-DH酶活缺失型突变株 Gluconobacter oxydans MF1，此突变株不生成2KGA，使5KGA的转化率达到84%。文中以不生成2KGA的氧化葡萄糖杆菌Gluconobacter oxydans HGI-1为生产菌株，研究不同碳源和氮源对5KGA生成的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

1.1.1 菌种

氧化葡萄糖杆菌 Gluconobacter oxydans HGI-1由日本玉川大学Tatsuo Hoshino教授赠送。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：甘露醇 25，酵母浸粉 5，蛋白胨 3。

摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50，KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25，MnSO4·5H2O 0.03，CaCO330。

发酵罐发酵培养基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50， KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25， MnSO4·5H2O 0.03，CaCO30.34。

1.2 培养和检测方法

1.2.1 种子液制备

从斜面上挑取两环菌种于液体种子培养基中，摇床 (30 ℃，180 r/min)培养20 h。

1.2.2 摇瓶培养

500 mL三角瓶装液量为 50 mL，接种量为10%，摇床 (30 ℃，180 r/min)培养72 h。

1.2.3 5 L发酵罐放大培养

采用5 L全自动发酵罐 (BLBIO-XGJG,上海百仑生物科技有限公司)，培养基装液量为3 L，接种量为10%(V/V)，在发酵过程中，控制温度为30 ℃，搅拌转速为750 r/min，通气速率为1 vvm，自动流加6 mol/L KOH控制发酵过程中的pH在5.50，葡萄糖浓度降至0 g/L时，不再控制pH。发酵过程由发酵罐控制系统软件进行在线控制和数据采集。

1.2.4 5-酮基-D-葡萄糖酸的测定

采用高效液相色谱仪(型号：1100，安捷伦(中国)有限公司)测定5-酮基-D-葡萄糖酸的含量。具体条件：反相色谱柱 Themos BDS C18(4.6 mm ID×250 mm)，流动相为 10 mmol/L HClO4[21]，流速0.5 mL/min，柱温25 ℃，检测波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 碳源对5KGA生产的影响

2.1.1 碳源种类对5KGA产量的影响

分别以初始浓度为100 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉作碳源，三角瓶振荡培养72 h。由图1可知，当碳源分别为乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和葡萄糖时，5KGA的产量分别为16.50、11.90、25.00、45.60和98.20 g/L，其中葡萄糖为碳源时5KGA产量最高，这可能是由于蔗糖、麦芽糖、乳糖为二糖，可溶性淀粉为多糖，不易被菌体利用，菌体利用上述碳源时，需先将其水解为单糖，才能被菌体利用生成5KGA。而葡萄糖能直接被菌体利用，更有利于5KGA的生成，因此选用葡萄糖作碳源。

图1 不同碳源对5KGA产量的影响Fig. 1 Effects of different carbon sources on the 5-keto-gluconic acid production.

2.1.2 葡萄糖浓度对5KGA产量的影响

选择葡萄糖初始浓度分别为 60、80、100、120和140 g/L，三角瓶振荡培养72 h。由图2可知，当葡萄糖浓度在60–100 g/L时，5KGA的产量随葡萄糖浓度的增大而增大，100 g/L时最高为 98.21 g/L，而当葡萄糖浓度再增大时 5KGA的产量反而下降，这说明较低或较高的葡萄糖浓度皆不适宜5KGA的生成，这可能是由于高浓度的葡萄糖抑制了菌体的生长[22]，从而影响了5KGA的生成。

图2 不同葡萄糖浓度对5KGA产量的影响Fig. 2 Effects of different glucose concentrations on the 5-keto-gluconic acid production.

2.2 有机氮源对5KGA生产的影响

2.2.1 有机氮源种类对5KGA产量的影响

以鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉和棉籽饼粉为氮源，其蛋白含量分别为55%、40%、38%和40%，按蛋白终含量为1.20%分别添加2.20、3.00、3.15和3.00 g，以酵母粉为(蛋白含量为 68%)对照，其添加量为1.67 g/L，三角瓶振荡培养72 h。由图3可知，当使用酵母粉作氮源时，5KGA产量为98.21 g/L。当使用鱼粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉籽饼作有机氮源时，5KGA产量分别为101.40、79.20、70.10和62.10 g/L。鱼粉和玉米浆作氮源产量较黄豆饼粉、棉籽饼高。鱼粉作氮源时产量超过酵母粉作氮源时的产量，虽然差异未达到显著性水平(数据未列出)，但考虑到鱼粉和玉米浆的价格优势，有望作为工业化生产氮源。

2.2.2 鱼粉、玉米浆起始浓度对5KGA产量的影响

图3 不同氮源对5KGA产量的影响Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on the 5-keto-gluconic acid production.

分别添加鱼粉(1.50/2.20/3 g)、玉米浆(2/3/4 g)作为氮源，其最终蛋白含量分别为0.80%、1.20%和1.60%，三角瓶振荡培养72 h。由图4可知，当培养基中蛋白含量为1.60%时，鱼粉作有机氮源，5KGA产量最高为109.10 g/L，其次是使用玉米浆时，5KGA产量最高为93.80 g/L。考虑到玉米浆作氮源与鱼粉作氮源5KGA产量接近，但价格仅为鱼粉的40%左右，文中选择了玉米浆为氮源，进一步做了5 L发酵罐放大研究。

2.3 5 L自动发酵罐分批发酵

5 L自动发酵罐分批发酵过程中，葡萄糖浓度降至0 g/L之前，自动流加6 mol/L KOH控制发酵过程中的pH在5.50，葡萄糖浓度降至0 g/L后，不再控制 pH。这是由于 1991年 Qazi等[23]发现pH为5.50 最利于G. oxydans的细胞生长，且是葡萄糖脱氢酶的最适 pH。5KGA生成过程可分为两个阶段，即先将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，葡糖酸再进一步转化成 5KGA[20]，葡萄糖氧化生成葡萄糖酸后，pH下降，葡萄糖浓度降为0 g/L，pH不再降低。在第一阶段中，为了保证菌体最大限度地利用葡萄糖并将其氧化成葡萄糖酸，控制 pH为5.50，这有利于细胞生长和葡萄糖转化成葡萄糖酸[24]。

图4 不同蛋白浓度鱼粉、玉米浆对5KGA产量的影响Fig. 4 Effects of different protein concentrations of fish meal and corn steep liquor on the 5-keto-gluconic acid production.

由图5(A)和图6(A)可知，以酵母粉作有机氮源时，发酵9 h葡萄糖的浓度降至0 g/L、5KGA开始生成，10.5 h时生成速率最大、达到8.60 g/(L·h)，72 h时5KGA产量达到最大、为105.41 g/L，转化率为90.60%，平均生成速率为 1.44 g/(L·h)。由图 5B 和 6B 可知，以玉米浆作有机氮源，18 h时5KGA开始生成，5KGA 生成速率在 26 h时达最大，为3.48 g/(L·h)，60 h时5KGA产量达到最大，为93.80 g/L。平均生成速率为1.56 g/(L·h)，转化率为85.93%。

图5 以酵母粉(A)和玉米浆(B)作氮源分批发酵生产5KGAFig. 5 Time course of batch 5KGA production with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

图6 以酵母粉(A)和玉米浆(B)作氮源5KGA生成速率曲线Fig. 6 Time course of 5KGA specific production rate with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

以玉米浆作有机氮源 5KGA的产量与酵母粉作有机氮源接近，玉米浆成本远低于酵母粉，同时发酵周期缩短，平均生成速率为1.56 g/(L·h)高于以酵母粉作有机氮源的平均生成速率1.44 g/(L·h)。

3 讨论

三角瓶和5 L发酵罐分批发酵放大试验结果表明：采用菌株Gluconobacter oxydans HGI-1生产 5KGA，最佳碳源为葡萄糖，最佳浓度为100 g/L。最佳氮源为酵母粉，其次为鱼粉、玉米浆。考虑工业生产成本问题，选择玉米浆作为有机氮源，其最佳添加量为 4 g/L。以葡萄糖为碳源、玉米浆为有机氮源 5KGA 的发酵水平达到了93.80 g/L，平均生成速率为1.56 g/(L·h)，转化率为85.93%，发酵周期较酵母粉缩短15 h，5KGA平均生成速率提高 8.26%，取得了较好的实验效果。

Hirohide TOYAMA等[25]研究了以葡萄糖为唯一碳源，在葡萄糖浓度为20 g/L (111 mmol/L)、不控制pH条件下，G. suboxydans IFO 12528生成5KGA的产量为12.61 g/L，转化率仅为59%。Helmut Görisch等[19]筛选出一株核黄素依赖型GA-2-DH酶活缺失型突变株 Gluconobacter oxydans MF1，使用酵母粉作有机氮源，葡萄糖浓度为25 g/L时，5KGA的产量为22.70 g/L，其葡萄糖转化率为84%。与其相比，Gluconobacter oxydans HGI-1以葡萄糖为碳源、玉米浆为有机氮源生产5KGA转化率与文献水平相当，但以玉米浆作氮源降低了生产成本，更有利于工业化生产。

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