核酸定量检测试验应用于HIV-1感染实验室诊断的探讨

李繁，蒋岩，张桂云，蒲鑫，潘品良

中国疾病预防控制中心 性病艾滋病预防控制中心，北京 102206

自1997年《全国艾滋病检测工作规范》实施以来，人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi⁃rus，HIV）抗体检测作为HIV实验室诊断主要检测手段的检测策略已在我国实行了十几年的时间。《全国艾滋病检测技术规范》2009年版规定，HIV抗体检测分为筛查试验（最常用的为酶联免疫吸附试验，ELI⁃SA）和确证试验（蛋白印迹法，Western印迹）[1]。

HIV抗体检测只适用于HIV感染窗口期后艾滋病患者整个病程中的艾滋病实验室诊断，不适用于HIV感染窗口期和HIV阳性母亲所生18个月以下婴儿（由于母体抗体的干扰）。此外，受被检测者自身免疫状况、病程及感染其他疾病的影响，以及高敏感性的检测方法和试剂等原因，抗体确证试验经常会出现“抗体不确定”样本[2]。此类样本须结合流行病学资料进行3个月后的跟踪随访，这给受检者带来巨大的精神压力，也不利于HIV的提早治疗和预防。

HIV-1核酸定量（HIV-1病毒载量）检测方法直接检测血液中HIV的RNA量，可早于Western印迹检测出血浆中的病毒，已经越来越受到人们的关注。在此，我们拟综合对比分析HIV-1核酸定量试验和Western印迹检测结果，探讨HIV-1核酸定量检测用于HIV-1感染实验室诊断的可行性，分析此方法在实际应用中的优点和局限性。

1 材料和方法

1.1 标本来源

选取参比室库存的145例第四代筛查试剂检测结果为阳性的血浆样本。

1.2 检测方法

1.2.1 确证试验（Western印迹，以下简称WB）采用MP生物医学公司HIV1+2型抗体检测试剂盒（免疫印迹法，HIV BLOT2.2），仪器为Autoblot system 20免疫印迹仪。

1.2.2 HIV-1核酸定量检测试验（病毒载量试验）采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS Taq⁃Man HIV-1 Test V2.0试剂盒，仪器为Roche公司Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自动分析系统。

以上试验操作均严格按照试剂盒和仪器说明书进行，所有检测试剂均在有效期内。

1.3 WB判定标准

严格按照试剂盒说明书判定。HIV-1抗体阳性要求至少检出2条env带（gp41和gp160/gp120）及gag带（p55、p24、p17）或 pol带（p66、p51、p31）；HIV抗体阴性是指无HIV抗体特异带出现；HIV抗体不确定性是指出现HIV抗体特异带，但不足以判定为阳性。

2 结果

2.1 HIV-1核酸定量检测试验和WB检测结果比较

对145例样本分别进行WB和HIV-1核酸定量检测试验，WB检出阳性样本120例，阴性8例，结果不确定17例；核酸定量试验检出131例，结果为“TND”的14例。见表1。

2.2 病毒载量值的分布

131例HIV-1核酸定量试验检出样本中，69例病毒载量log10值为4～5，所占比例为52.7%；log10值为3～4的样本36份，所占比例27.5%；log10值大于5的样本18份，所占比例为13.8%；log10值小于3的样本8份，所占比例为6.0%。见表2。

2.3 WB不确定样本及HIV-1核酸定量试验和WB结果不一致样本比较

表1 HIV-1核酸定量检测试验和WB检测结果比较

表2 HIV-1核酸定量检测结果分布

HIV-1核酸定量试验检出12例WB结果不确定样本，2例WB阴性样本；有3例WB结果为阳性的样本，HIV-1核酸定量试验结果为“TND”。见表3。

3 讨论

多年来，由于体外HIV核酸扩增试验操作步骤较复杂，受实验室环境和操作者影响因素多，容易污染而导致假阳性，HIV-1核酸定量检测大多用来评估HIV感染进程和监测抗病毒疗效，一般不作为诊断依据。《全国艾滋病检测技术规范》（2009年修订版）中规定HIV核酸检测只能作为辅助诊断依据，确诊仍然需要HIV抗体确证试验结果。随着科技的发展，HIV-1核酸定量检测技术有了很大的进展，自动化程度也日益提高，如Cobas AmpliPrep/Cobas Taq⁃Man全自动分析系统，核酸扩增和检测程序全部在密闭的仪器中由机械臂进行自动化操作，完全代替了手工提取，大大降低了污染风险，使得检测的精确度也大幅度提高。

从表1可看出，有117例样本的WB和HIV-1核酸定量试验结果一致，均为阳性。25例WB结果不确定和阴性样本中，HIV-1核酸定量试验检出14例，其中10例病毒载量值＞104拷贝/mL（表2、3），符合HIV急性/早期病毒免疫学特征，可以判断为HIV急性/早期感染；其余4例病毒载量值为612～2360拷贝/mL（表3），低于通常在急性/早期感染所见到的高病毒载量。由于本实验使用的是实验室库存样本，缺少临床和随访资料，无法得知样本来源者的真实感染状态及病毒治疗相关信息，所以无从验证HIV-1病毒载量对这几例样本的诊断结果。出现这种情况，可能是因为样本采集于HIV感染病毒储存库建立初期，病毒载量值还处于较低水平；或者是由于样本采集、保存和运输不当等原因造成的核酸降解；也不能排除是实验室误操作、交叉污染等原因造成的假阳性结果。国外文献曾报道病毒载量值较低的假阳性案例[3]，对于病毒载量值高于检测限但小于5000拷贝/mL的样本，通常视为可能存在假阳性结果[4-5]，建议再采集一份血浆进行HIV-1核酸定量检测试验。

表3 WB不确定样本及WB和病毒载量试验结果不符合样本列表

有3例WB检测结果为阳性的样本，病毒载量检测结果为“TND”（表3）。这是由于HIV-1核酸定量方法本身有最低检测限（如COBAS AmpliPrep/CO⁃BAS TaqMan HIV-1 Test V2.0试剂盒的检测下限为20拷贝/mL），检测结果为“TND”只能代表未检出。曾经有报道，有少数未经治疗且抗体检测阳性的感染者，血液中病毒含量长期处于低水平状态，HIV-1核酸检测试验无法检出[6-8]；检测非B亚型时，HIV-1亚型变异导致的基因差异也可能出现检测值被低估[9-12]的情况；此外，现有的HIV-1核酸定量检测试剂无法检测HIV-2的样本。所以，对于HIV-1核酸定量检测结果为“TND”的样本，建议加做WB试验或结合其他补充试验结果来进行综合诊断。

人体感染HIV后，首先在血液中检出的是HIV RNA和p24抗原，急性期感染者血浆中病毒RNA急剧复制，最高可达107拷贝/mL[13]，HIV-1急性期感染者的传染性明显高于情况已稳定的感染者，有研究显示大约50%以上的HIV传播发生在HIV感染急性早期阶段[14]，所以HIV-1核酸定量试验对于HIV急性/早期感染样本的意义尤其重要。在本研究中，HIV-1核酸定量试验比传统的实验室诊断（WB）方法有更高的敏感性，可以检出由于急性/早期感染等原因导致WB试验无法诊断的阳性样本，弥补传统WB诊断试验的不足。

另外，HIV-1核酸定量试验对于样本质量、实验室环境和操作者的要求较高，HIV-1核酸定量试验需要使用质量较高的血浆，可能存在肝素的样本，重度溶血、变质、乳糜血、反复冻融样本和由于温度等原因造成的保存不当等样本不适合用HIV-1核酸定量试验进行检测。在日常工作中，也要求我们要加强实验室质控，杜绝实验室污染。

[1]中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[Z].2009.

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[4]New York State Department of Heather AIDS Institute.Diag⁃nostic,monitoring,and resistance laboratory tests for HIV.Up⁃dated February 2011;section updates January 2014;section updates January 2014[E/OL].http://www.hivguidelines.org/wpcontent/uploads/2014/01/diagnostic-monitoring-and-resistancelaboratory-tests-for-hiv.pdf[2014-04-16].

[5]New York State Department of Heather AIDS Institute.Diagno⁃sis and management of acute HIV infection.Updated January 2010-Currently under Revision[E/OL].http://www.hivguidelines.org/wp-content/uploads/2012/10/diagnosis-and-management-ofacute-hiv-infection-10-16-2012.pdf[2014-04-16].

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