地肤子提取物毒杀螨的蛋白组双向电泳分析

张利军，王海香，李生才，李玲，曹挥

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 林学院，山西 太谷030801）

山楂叶螨（Tetr anychus viennensis Zacher）属蛛形纲（Arachnida）螨目（Acarifor mes）叶螨科（Tetranychidae），是我国北方果区核桃、苹果、梨、樱桃、山楂树的主要害螨，常造成叶片枯焦早落，削弱树势，影响产量［1］。目前，对该螨的控制主要依赖化学农药，已经产生了严重抗性［2］。

植物源杀虫剂对环境污染小、害虫较难产生抗药性，对有益生物较安全，还有降低害螨迅速产生农药抗性的潜能［3］。已有研究表明，瑞香狼毒、河蒴荛花、牵牛子、旋覆花、砂地柏、百部、苦艾等的活性成分对成、若螨有较好的防效，有的具有杀卵活性甚至熏杀毒力，部分混用还有增效作用［4～10］。地肤子（Kochia scoparia）是藜科1年生草本植物，俗名扫帚苗、扫帚菜。地肤子提取物有很好的杀螨活性［11］，地肤子提取物处理后，螨体内解毒酶和消化酶的含量均有所变化［12］。但地肤子活性成分作用的靶标蛋白区域究竟在哪里，目前尚没有相关研究。

蛋白质是生命功能的执行体，蛋白质组学在蛋白水平上定量、动态、整体地研究生物体，阐明生物体全部蛋白的表达模式及功能模式［13］。通过比较正常体与病变体，给药前后蛋白图谱的变化，药物蛋白组学可提供药物作用和药物反应的分子机制信息［14］。目前蛋白组研究主要是利用双向聚丙烯酰 胺 电 泳 （Two－di mensional electr ophoresis，2－DE）来分离复杂的蛋白组分。近年来，2－DE被广泛应用于医学、农业和微生物学等研究领域［15，16］。在昆虫学研究方面，2－DE应用于碟蛹金小蜂卵黄蛋白、家蚕雄性附腺及其Ng突变体蛋白质、抗性家蝇蛹期蛋白和冈比亚按蚊唾液蛋白［17～20］。在药物蛋白组学中，2－DE也为定量和定性评价具有不同表型或基因型的组织细胞之间、正常与病理状态、给药与不给药时蛋白质表达差异提供了可能［21］。多项研究结果显示，毒性效应可以通过蛋白的方式显示出来［22，23］。

蛋白组学研究有害螨报道较少，本文通过2－DE技术分析给药与不给药时山楂叶螨蛋白质表达差异，研究药物靶标识别和确认、药物的行为机理，为开发利用杀虫植物地肤子防治山楂叶螨奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

山楂叶螨来自山西农业大学试验果园核桃树上饲养的敏感品系，地肤子氯仿提取物由山西农业大学植物病理实验室提供。

1.2 方法

将供试山楂叶螨分对照组和处理组放在不同的培养皿内，分别用清水和1 mg·mL－1地肤子提取物喷洒在山楂叶螨体表，5 s后吸净体表液体，24 h后用液氮快速冷冻并转移到离心管中，称其重备用。

参照Tal等［24］的方法提取总蛋白，用Bradfor d法测定蛋白质浓度，等电聚焦采用胶内加样法，第一向等电聚焦电泳p H 3～10，线性固化IPG干胶条长度17 c m，蛋白加样量为200μg。SDSPAGE分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为5%，电泳后凝胶染色银染色，银染色采用Yan etal.的方法［25］。图像扫描后用 PDQuest 2－DE 8.0.1软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 对照和处理蛋白质组图谱

供试山楂叶螨从培养到双向电泳各重复3次，供试药剂处理山楂叶螨和对照的蛋白双向电泳银染图谱如图1所示，其Patter n非常相似。对照胶得出蛋白点1139±102个，处理胶得出点1183±106个。这些蛋白点等电点和分子量分布范围广，但多数集中于等电点5.0～9.0之间，分子量20～70 ku的区域。从对照凝胶中选取一个图谱做蛋白点匹配实验，使处理凝胶中蛋白点与对照胶中的对应起来，与对照胶中同一蛋白点相匹配的点为同一种蛋白质，匹配结果显示两块胶相匹配的蛋白点为500±45个，对照胶和处理胶平均匹配率分别为43.8%和42.3%。对照的匹配率稍高于处理胶，这与把它选做参考胶有关。

2.2 对照和处理蛋白组的表达变化

以对照胶作为参照，通过PD－QUEST软件搜索和数据的统计分析，发现有262±23个蛋白点在表达量上有显著变化（P＜0.05），其中142±13个点是2倍上调的点，另外120±11个点是下调的点，介于两者之间的点有237±21个。与对照相比处理蛋白组差异表达谱见图2。同时322±29个点只在处理胶中，其中蛋白点参数（等电点和分子量）见表1，蛋白点主要集中区如图2中框1所示。表1显示蛋白分子量主要集中在30～70 ku，等电点集中在pI（5～6）和pI（7.5～9.0）之间。发生变化的蛋白是中等分子的蛋白，在pI（5～6）区处理胶明显增加了一些蛋白。

图1 供试药剂对山楂叶螨蛋白影响双向凝胶电泳图谱Fig.1 Comparison of 2－DE maps of T.viennensis Zacher treated by agents

图2 对照和处理叠加的蛋白比较Fig.2 Comparison of 2－DE maps on super position of two gels

表1 药剂处理凝胶中增加蛋白质点的参数Table 1 The parameter of increased protein spots on the treated gel

3 讨论与结论

蛋白质组学在药物研究中主要应用于受体或标志物的鉴定、受体的评价及毒理学、蛋白质相互作用及其功能的研究、药物代谢产物的研究等方面［26］。有人运用蛋白质组学2－DE技术研究过杀虫剂对有害昆虫的毒理，如Shar ma等研究了p H3.5～7.0和p H6.0～10.0氨基甲酸酯类杀虫剂对褐飞虱的毒性机理［27］，他指出被氨基甲酸酯类农药处理后所有的细胞骨架蛋白被引起上调，而这些蛋白是神经化学物质的重要靶标之一。本试验采用地肤子提取物触杀山楂叶螨，引起其蛋白显著性变化（P＜0.05），显著性变化的蛋白有可能是地肤子提取物的靶标蛋白。

曹挥等［28］研究表明，地肤子提取物处理后，山楂叶螨体内蛋白含量、蛋白酶活性有所升高，谷胱甘肽－S－转移酶和羧酸酯酶被激活，SOD活性显著增高；乙酰胆碱酯酶、Ca2＋－ATP酶活力受到一定程度的抑制。并推断地肤子活性成分可能通过抑制山楂叶螨体内的酯酶同工酶活性来降低其消化代谢，通过降低单胺氧化酶的活性来降低其解毒代谢，通过抑制乙酰胆碱酯酶活性阻断其神经传递，再加上自由基毒害引起螨过度兴奋，最终导致螨体的死亡。而本试验中研究发现地肤子提取物触杀螨可引起中等分子量酸性蛋白质增加。SWISS－2DPAG数据库显示乙酰胆碱酯酶的前体的等电点在pI（5.17～5.26）之间［29］，处理胶酸性蛋白的增加恰是在pI（5～6），可能存在乙酰胆碱酯酶受到抑制，其前体不能正常转化，停留在前体状态积聚起来，同时引发了与其相关的一系列蛋白的错误表达。同时，谷胱甘肽－S－转移酶的分子量为55 ku，等电点pI（4.5～4.8）作为昆虫解毒代谢作用和动物组织损伤的敏感指标，其升高也可能造成组织内蛋白的表达混乱。如果这种假设正确，恰好和酶活性测定的结果相吻合，但是这种假设需要进一步研究验证。

蛋白质是基因表达的产物，它的形成要经过基因组的转录后加工、翻译调控以及翻译后加工修饰等许多步骤，每个蛋白可产生多种蛋白异构体，极大丰富了蛋白质的数量，增加了复杂性。但是，试验结果说明运用蛋白技术在分子水平研究杀虫剂的毒性是可能的，部分蛋白的研究将有助于目标基因的鉴定和功能的预测。因此需要进一步采用其他方法或手段深入地研究鉴定这些蛋白，并了解它们的功能。

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