预防性给予维生素D对实验性脑疟前炎症应答的影响

朱晓彤，冯永辉，曹雅明，刘英杰

(1.中国医科大学基础医学院免疫学教研室，辽宁 沈阳 110001;2.中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)

疟疾是严重威胁人体健康的寄生原虫感染性疾病，全球每年至少有一百万人死于疟疾感染［1］。脑疟(Cerebral Malaria，CM)是疟疾感染后最严重的并发症，是5岁以下儿童感染疟疾致死的主要原因之一［2］。因此，研发有效抗疟药物和疫苗在防治疟疾中至关重要。维生素D(Vitamin D，VD)是一种脂溶性类固醇激素，其主要作用是维持骨骼健康。但近年研究发现，VD在自身免疫性疾病［3］、心血管疾病［4］、感染性疾病和癌症［5］中亦发挥免疫调节作用。同时，VD可抑制Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)、Th17细胞因子(IL-17和IL-21)的分泌，并通过刺激Th2型细胞因子(IL-4)的产生［6］，间接调节初始T细胞亚群向Th1、Th2和Th17各亚群的分化过程。此外，由于活化T细胞表达VD受体(VDR)，VD亦可直接抑制Th1类细胞亚群分化，并促进调节性 T细胞(Tregs)分化［7］，直接影响T细胞免疫应答。虽然VD有多种免疫调节作用，但VD在疟疾中的研究尚处于空白。为此，本研究利用P.b ANKA感染C57BL/6小鼠建立的实验性脑疟(Experimental Cerebral Malaria，ECM)模型，观察预防性给予宿主 VD治疗对于疟疾感染后宿主免疫应答强度的影响，以期为脑疟治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疟原虫 6～8周龄、雌性 C57BL/6，BALB/c小鼠购自北京动物研究所;P.b ANKA由日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠。

1.1.2 主要试剂 VD、伊文思蓝及甲酰胺购自Sigma-Aldrich公司，使用前用豆油溶解;ELISA试剂盒购自R＆d公司。

1.2 方法

1.2.1 ECM模型建立及VD处理 C57BL/6小鼠分别经腹腔感染1×106P.b ANKA寄生的红细胞(pRBC)建立ECM模型。于感染后每日观察生存率，在不同时间点，经小鼠尾静脉采血制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。在P.b ANKA感染前给予VD组小鼠口服VD 50 μg/kg，1次/d，连续7 d。对照组小鼠在相同的时间点给予同样体积的大豆油。

1.2.2 血脑屏障通透性检测 感染P.b ANKA后第8天，C57BL/6小鼠静脉注射200 μL伊文思蓝染料。1 h后，经心脏灌注生理盐水，至流出清亮的液体，取脑，放入装有1 mL甲酰胺的中号试管中，37℃温箱孵育48 h，3000 r/min离心15 min，取上清液，于紫外分光光度仪上(波长630 nm)测定染料溢出物，检测血脑屏障(BBB)的通透性。

1.2.3 脾细胞的制备和培养 感染后不同时间点杀鼠，留取血清。无菌条件下取出正常和感染小鼠的脾脏，采用200目筛网研磨后，用10 mL含10%热灭活的小牛胎血清(FCS)，25 mmol/L Hepes，0.12%庆大霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基制成细胞悬液。收集细胞悬浮液350 × g，室温离心 10 min，采用冷 0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞，RPMI 1640洗涤2次。采用含10%FCS的RPMI 1640将脾细胞终浓度调整至1×107个/mL，接于24孔培养板(FALCON)中，每孔加入500 μL细胞悬液，设3个复孔，37℃培养48 h，收集上清，－80℃保存，用于细胞因子及NO测定。

1.2.4 ELISA检测和 Griess反应 根据相应ELISA试剂盒说明书检测脾上清和血清中IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平。同时采用Griess反应测定上清液中NO水平。

1.2.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，采用Kaplan-Meyer方法比较2组小鼠的生存期，通过独立样本t检验进行数据统计分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 预防性给予VD治疗对实验性脑疟模型鼠感染率和生存期的影响

如图1所示，对照组小鼠在P.b AKNA感染后9～11 d发生 ECM死亡，原虫血症水平约15%。与对照组相比，VD治疗组小鼠无脑疟症状产生，原虫血症水平随感染进程均显著上升达61%，小鼠在感染后15～17 d死于重度贫血(与NC组相比，P＜0.01)。结果表明，预防性给予VD能保护C57BL/6小鼠发生ECM。

2.2 预防性给予VD治疗对实验性脑疟模型鼠血脑屏障完整性的影响

在感染后第8天，小鼠尾静脉注射2%伊文思蓝染料，通过测定伊文思蓝染料外渗量检测血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的完整性。与对照组相比，预防性给予VD治疗组小鼠脑组织的伊文思蓝渗出显著减少(图2)。这一观察结果表明，预防性给予VD治疗可显著改善ECM小鼠的脑血管完整性。

图1 预防给予VD对实验性脑疟模型感染率(A)和生存期(B)的影响Fig.1 Effects of pre-treatment with vitamin D on the parasitemia and survival of ECM

图2 预防给予VD对实验性脑疟模型血脑屏障的影响Fig.2 Effects of pre-treatment with vitamin D on BBB of ECM mice

2.3 预防性给予VD治疗对实验性脑疟模型鼠前炎症细胞因子水平的影响

在小鼠感染后第0、3、5和8天，检测VD组和对照组脾细胞培养上清(图3A、B)和血清(图3D、E)中IFN-γ和 TNF-α 水平。研究发现，在感染后第5、8天，对照组脾上清和血清中IFN-γ及TNF-α水平显著升高。VD组TNF-α水平在感染后第5天亦显著升高。在感染后第8天，VD组脾细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α水平显著低于对照组(P＜0.05)。同时血清中的IFN-γ和TNF-α水平在感染后第5天，VD组显著低于对照组(P ＜0.05)。

进一步分析预防性给予VD治疗对脾细胞培养上清中NO(图3C)产生水平的影响发现，与对照组在感染后第5天和第8天NO水平显著升高相比，P.b ANKA感染后VD组NO水平无明显上升，且在感染后第5天和第8天均显著低于对照组(P＜0.05)。上述研究结果表明，VD预防性给药治疗能够调节疟疾感染早期宿主前炎症免疫应答反应。

图3 预防给予VD对实验性脑疟模型前炎症细胞因子的影响Fig.3 Effects of pre-treatment with vitamin D on pro-inflammatory cytokines

2.4 预防性给予VD对抗炎性细胞因子IL-10的影响

抗炎性细胞因子IL-10对Th1型免疫应答具有抑制作用，因此本研究检测了脾上清(图4A)和血清(图4B)中IL-10水平。研究发现，在感染后第5、8天，对照组和VD组IL-10分泌水平均显著增加，但VD组感染后第5、8天IL-10的分泌明显高于对照组(P＜0.05)。此研究结果表明，VD治疗可以增加IL-10分泌水平，从而抑制P.b ANKA感染后ECM的发生。

图4 预防性给予VD对抑制性细胞因子IL-10的影响Fig.4 Effects of pre-treatment with vitamin D on IL-10

3 讨论

有研究表明，高原虫血症和过强的前炎症免疫应答是导致CM发生的重要因素［8］，而VD具有抑制前炎症免疫应答反应，减少自身免疫性疾病症状发生的作用［9］。本研究结果表明预防性给予VD治疗，可通过抑制ECM模型小鼠过强的前炎症应答，从而延长小鼠生存期。

疟原虫感染小鼠早期前炎症细胞因子，如IFN-γ、TNF-α 和 NO 分泌水平显著上升［10-11］。研究表明，过强的Th1免疫应答在CM病理中发挥重要作用［12］，可促进脑疟发生。中和小鼠体内的IFN-γ可防止CM的发生并降低死亡率［13］。本研究发现，预防性给予VD治疗，可显著降低P.b ANKA感染小鼠体内IFN-γ和TNF-α水平。

早期研究显示，疟疾感染过程中NO分泌水平显著增加。作为固有免疫应答的重要组成部分，NO由脾脏中巨噬细胞产生［14］。高水平 NO可杀死疟原虫但也会对宿主产生不良影响。高浓度NO可能会扰乱其在中枢神经系统(CNS)的调节作用，导致意识障碍的脑型疟疾的发生［15］。本研究发现，P.b ANKA感染前，预防性给予VD可抑制感染过程中NO的分泌。由于前炎症细胞因子水平显著降低，可保护小鼠抵御脑疟发生。

VD单独或联合地塞米松可在APC体外系统诱导 Tregs产生 IL-10［16］，Baeke 等报道，VD 可诱导CD4+CD25highCD127low表型的Tregs分化成熟，并选择性诱导CD4+T细胞亚群表达IL-10，在自身免疫性疾病和器官移植排斥反应中对宿主起到保护性作用［17］。本研究发现，VD预防性给药治疗可以通过提高IL-10水平抑制ECM发生。

前炎症和抗炎症免疫应答之间的平衡对控制疟疾发病至关重要。本研究表明，预防性给予VD治疗，可通过抑制宿主过强的前炎症免疫应答防止脑疟的发生，从而延长小鼠生存期。上述研究结果为疟疾防治的研究提供了有力的理论依据。

［1］Rénia L，Howland SW.Targeting the olfactory bulb during experimental cerebral malaria［J］.Trends Parasitol，2014，pii:S1471-4922(14)00088-9.

［2］Kotlyar S，Nteziyaremye J，Olupot-Olupot P，et al.Spleen volume and clinical disease manifestations of severe Plasmodium falciparum malaria in African children［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，2014，108(5):283-289.

［3］Costenbader KH，Feskanich D，Holmes M，et al.itamin D intake and risks of systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis in women［J］.Ann Rheum Dis，2008，67(4):530-535.

［4］Van der Schueren BJ，Verstuyf A，Mathieu C.Straight from DHeart:vitamin D status and cardiovascular disease［J］.Curr Opin Lipidol，2012，23(1):17-23.

［5］Toriola AT，Nguyen N，Scheitler-Ring K，et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D Levels and Prognosis among Cancer Patients:A Systematic Review［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014，23(6):917-933.

［6］Giulietti A，van Etten E，Overbergh L，et al.Monocytes from type 2 diabetic patients have a pro-inflammatory profile.1，25-Dihydroxyvitamin D(3)works as anti-inflammatory［J］.Diabetes Res Clin Pract，2007，77(1):47-57.

［7］Jeffery LE，Burke F，Mura M，et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 and IL-2 combine to inhibit T cell production of inflammatory cytokines and promote development of regulatory T cells expressing CTLA-4 and FoxP3［J］.J Immunol，2009，183(9):5458-5467.

［8］Pais TF，Chatterjee S.Brain macrophage activation in murine cerebral malaria precedes accumulation of leukocytes and CD8+T cell proliferation［J］.J Neuroimmunol，2005，163(1-2):73-83.

［9］Cantorna MT，Munsick C，Bemiss C，et al.1，25-Dihydroxycholecalciferol prevents and ameliorates symptoms of experimental murine inflammatory bowel disease［J］.J Nutr，2000，130(11):2648-2652.

［10］Su Z，Stevenson MM.Central role of endogenous gamma interferon in protective immunity against blood-stage Plasmodium chabaudi AS infection［J］.Infect Immun，2000，68(8):4399-4406.

［11］Dascombe MJ，Nahrevanian H.Pharmacological assessment of the role of nitric oxide in mice infected with lethal and nonlethal species of malaria［J］.Parasite Immunol，2003，25(3):149-159.

［12］Belnoue E，Kayibanda M，Vigario AM，et al.On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+T cells in experimental cerebral malaria［J］.J Immunol，2002，169(11):6369-6375.

［13］Ya～nez DM，Manning DD，Cooley AJ，et al.Participation of lymphocyte subpopulations in the pathogenesis of experimental murine cerebral malaria［J］.J Immunol，1996，157(4):1620-1624.

［14］Breuillard C，Belabed L，Bonhomme S，et al.Arginine availability modulates arginine metabolism and TNFα production in peritoneal macrophages from Zucker Diabetic Fatty rats［J］.Clin Nutr，2012，31(3):415-421.

［15］Clark IA，Cowden WB.The pathophysiology of falciparum malaria［J］.Pharmacol Ther，2003，99(2):221-260.

［16］Unger WW，Laban S，Kleijwegt FS，et al.Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone:differential role for PD-L1［J］.Eur J Immunol，2009，39(11):3147-3159.

［17］Spach KM，Nashold FE，Dittel BN，et al.IL-10 signaling is essential for 1，25-dihydroxyvitamin D3-mediated inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Immunol，2006，177(9):6030-6037.