核黄素和脱乙酰几丁质对甘薯几丁质酶的诱导作用

朱刘影+张健+刘倩倩+徐悦+马媛媛+谢逸萍+刘美艳

摘要：利用甘薯黑斑病菌的孢子悬液诱导甘薯块根几丁质酶活性。结果表明，黑斑病浸染使甘薯块根几丁质酶活性上升，抗病品种南京-92块根内几丁质酶活性比感病品种烟台-252提高速度快、活性高、保持时间长，有利于抵抗病原菌的侵害。体外抑菌试验显示几丁质酶液对甘薯黑斑病菌具有较强的抑制作用。核黄素和脱乙酰几丁质处理均能诱导甘薯块根几丁质酶活性提高。

关键词：甘薯；黑斑病；几丁质酶；核黄素；脱乙酰几丁质

中图分类号：S435.313+.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0106-03

甘薯（Ipomoea batatas）是仅次于水稻、小麦和玉米的重要粮食作物，甘薯叶被世界卫生组织确定为最佳蔬菜^[1]。甘薯产乙醇能效高、无污染，是生物能源的理想材料之一。甘薯黑斑病（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）是危害甘薯的主要病害，在甘薯的种植和储藏过程中均有发生^[2]。目前对于甘薯抗黑斑病的研究多集中在筛选抗病品种和杂交育种方面^[3]，对于甘薯抗黑斑病机制方面的报道很少^[4-5]，研究也不深入。植物病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）是植物体内被病原菌等刺激物刺激产生的一类蛋白质，正常情况下含量并不高，一旦被诱导，含量迅速增加，从而提高植物对病虫害等逆境的防御能力^[6]。植物几丁质酶被认为是一类与植物抗病有着密切关系的病程相关蛋白。它参与了植物体内防御机制^[7-8]，在外界刺激物的刺激下可使植物体内本身含量较少的酶迅速积累。诱导物分为两大类，一类为生物性的刺激物，包括细菌、真菌、病毒类或者真菌细胞壁降解物^[9-10]，另一类为非生物性的刺激物，包括机械损伤、虫伤、脱乙酰几丁质、乙烯、水杨酸、紫外光、重金属盐等。通过诱导物来诱导甘薯几丁质酶含量上升和活性提高的研究未见报道。本试验研究了核黄素和脱乙酰几丁质对甘薯块根几丁质酶诱导作用，旨在为生产上防治甘薯黑斑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘薯品种为南京-92（高抗黑斑病）和烟台-252（高感黑斑病），甘薯黑斑病病原物，均由中国农科院甘薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑斑病菌孢子悬液的制备 黑斑病菌孢子悬液的制备按照王景景等的方法^[4]进行。

1.2.2 薯块接种 选取两个品种正常无病斑的薯块，用自来水冲洗干净，再放入0.1%的次氯酸钠溶液中，表面消毒 10 min，用蒸馏水冲洗3次。将块根切成约1.0 cm厚的圆片，将0.1 mL黑斑病菌内分生孢子悬液涂在块根圆片的表面，放置于28 ℃恒温箱中培养，以蒸馏水涂抹块根圆片的作为对照组。

1.2.3 几丁质酶的提取和活性测定 分别取两个品种染菌后的甘薯块根各0.5 g，加4 mL 0.02 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5），冰浴研磨，定容至5 mL，4 ℃ 8 000 r/mi，离心15 min，上清液为待测酶液。几丁质酶活力测定参照Boller等方法^[11]进行。酶活定义：以每小时分解胶体几丁质产生 1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。

1.2.4 甘薯几丁质酶体外抑菌试验

采用琼脂扩散法来检测甘薯几丁质酶体外抑菌的效果^[12]。PDA培养基冷却后，用灭菌后直径 7 mm的打孔器在平板上均匀打出6个孔洞。用无菌牙签挑出琼脂柱。在每个孔中加入少量未凝固的PDA封住孔底部，约2 mm厚度。然后将20 μL无菌酶液以及稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 的酶液分别加入孔中，最后用新的灭菌后的打孔器在活化好的待试菌种培养基上打一个菌饼，将其倒贴于加过菌液的培养基正中央，28 ℃培养箱中倒置培养4 d。通过比较病斑大小来判定几丁质酶的抑菌效果。检测对象为甘薯黑斑病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌。

1.2.5 核黄素和脱乙酰几丁质处理

脱乙酰几丁质原液的制备按王荣娟^[13]的方法进行。

将3 mL核黄素（1 mmol/L）和脱乙酰几丁质（1 mg/mL）均匀涂抹在薯块的表面，然后将薯块放入培养皿中，30±1 ℃暗箱中保温。试验各处理均设3次重复。数据采用SPSS Statistics软件进行统计分析。P<0.05（用*表示）为显著性差异，P<0.01（用**表示）为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 黑斑病侵染对不同抗性甘薯块根几丁质酶活性的影响

黑斑病对2种不同抗性甘薯块根内几丁质酶活性的影响见图1。从图1可以看出，未接种黑斑病菌时，南京-92和烟台-252块根中几丁质酶活性差异不显著。接菌后2个品种几丁质酶活性上升，于接菌后6 d达到最大值，而高抗品种南京-92块根几丁质酶活性增加速度高于高感品种烟台-252。差异分析表明，染菌4 d和8 d时南京-92块根几丁质酶活性显著高于烟台-252，2 d和6 d时两甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

2.2 甘薯几丁质酶对3种真菌的抑制作用

检测了甘薯几丁质酶对甘薯黑斑病菌、小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌的抑制作用（图2）。通过比较抑菌圈的大小可以看出：甘薯几丁质酶液（100）和稀释成10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5 的酶液对甘薯黑斑病菌（图2-A）有较明显的抑制作用，对小麦赤霉病菌（图2-B）和水稻纹枯病菌（图2-C）的抑制作用较小。

2.3 核黄素对不同抗性甘薯几丁质酶活性的影响

经核黄素处理后，2种不同抗性甘薯块中几丁质酶活性均呈现升高的趋势（图3）。高抗品种南京-92几丁质酶活性的上升幅度比高感品种烟台-252大，且在整个处理期间南京-92几丁质酶活性高于烟台-252。处理4 d和6 d时，南京-92几丁质酶活性是烟台-252的213.9%和175%。显著性分析表明，处理2 d和8 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异显著；处理4 d和6 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

2.4 脱乙酰几丁质对不同抗性甘薯几丁质酶活性的影响

脱乙酰几丁质能提高甘薯几丁质酶的活性（图4）。比较2个抗性不同甘薯品种几丁质酶活性的变化可以看出，南京-92几丁质酶活性的上升速度快且活性高于高感品种烟台台-252的221.9%和158.9%。显著性分析表明，处理2 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异显著；处理4 d、6 d和8 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

3 讨论

几丁质是真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶的底物为几丁质，因此植物几丁质酶能够直接降解真菌细胞壁，抑制真菌孢子萌发和菌丝生长，从而达到抑制真菌病害的作用^[14]。本试验结果验证了甘薯几丁质酶是一种诱导酶^[15-16]。未感染黑斑病时，高抗和高感薯块内几丁质酶活性都很低，并且差异不显著；受黑斑病菌感染后，两个品种薯块能够迅速积累几丁质酶来水解黑斑病菌的细胞壁，抑制菌丝的生长，高抗品种甘薯块内的几丁质酶比高感品种积累的量多，几丁质酶活性在处理 2 d 和6 d时达到极显著差异，说明几丁质酶对于甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。抑菌试验进一步证明了甘薯几丁质酶对甘薯黑斑病有较强的抑制作用。

几丁质酶是重要的病程相关蛋白，能够分解β-1，4键形成的线性几丁质，几丁质酶活性能够在抗性诱导过程中显著增强^[17]。研究表明，核黄素作为非专化激发子可以诱导植物产生系统获得抗病性^[18]。脱乙酰几丁质主要存在于海洋生物、昆虫的甲壳中，研究表明，脱乙酰几丁质能诱导植物提高抗病性[13，19]。本研究结果表明，核黄素和脱乙酰几丁质处理能提高甘薯块根几丁质酶活性，高抗品种酶活性高于高感品种，几丁质酶活性的上升有助于提高甘薯对黑斑病的抵抗能力。这与以玉米、番茄、苹果为试验材料的结果一致^[20-21]。本研究结果为生产上防治甘薯黑斑病提供了一种可行的方法。

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