武汉地区结核分枝杆菌链霉素耐药分离株rpsL基因分子特征研究

芦 莲，陈高瞻，黄小琴，雷 航，胡申才，李 睿，刘志国，余晓丽

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北武汉 430023;2.武汉轻工大学校医院，湖北武汉 430023)

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，伴随着整个人类发展史。据WHO统计，2011年全球约有870多万结核病病人，我国是全球22个结核病高发率国家之一，同时也是全球27个耐多药(MDR)结核病流行严重的国家之一［1］。链霉素(streptomycin，SM)作为最早应用于临床的氨基糖苷类抗生素，一直是最主要的一线抗结核药之一［2］，研究表明，核糖体30S亚基S12的编码基因rpsL突变是MTB对链霉素耐药的主要机制，16S rRNA编码基因rrs突变介导其对链霉素的耐药性［3］，且rpsL主要突变位点的突变率及突变类型有明显的地域差异［4］。笔者旨在探讨武汉地区结核分枝杆菌SM耐药临床分离株rpsL基因分子特征，为进一步研究结核分枝杆菌SM耐药机制和临床SM用药提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株来源及药物敏感性实验

结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC27294)购自中国药品生物制品鉴定所，71株临床分离株来源于武汉医疗救治中心2009年8月至2010年7月被诊断为结核病的患者，参照结核病诊断实验室检验规程［5］，采用比例法进行药敏试验(4 mg/L)，其中SM敏感株20株，SM耐药株51株(表1)。

1.2 MIC(最小抑菌浓度)测定

MIC采用刃天青法测定［6］。在96孔培养板中，用Middlebrook 7H9(BD公司)液体培养基将SM进行连续双倍稀释，倍比稀释终浓度依次为16—0.25 mg/L。每个梯度设3个重复，加入适量的菌液和刃天青(sigma公司)，置于37℃恒温培养箱中培养，每隔2 h观察一次颜色变化，MIC值为肉眼可见的颜色改变时的药物浓度。

1.3 DNA 制备

采用经典的酚/氯仿提取法［7］提取 DNA于－20℃保存。

1.4 rpsL基因PCR扩增

根据结核分枝杆菌H37Rv标准株rpsL(Gene ID:888259)基因，用Primer 5.0和 Oligo 6软件设计引物，引物对由上海生工生物工程股份有限公司合成。rpsL引物序列:5＇-GTAGATGCCAACCATCCAGC-3＇( 上游)，5＇-CATCAGCCCTTCTCCTTCTTA-3＇(下游);扩增381bp的核酸片段。采用50 μL反应体系，其中包括10 × PCR 缓冲液5 μL，2.5 mmol/L 四种 dNTP 各1 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板 5 μL，Taq 聚合酶0.4 μL，三蒸水 35 μL。PCR 反应程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;最后72℃ 5 min。待PCR扩增完成后，将PCR产物加样至1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 测序与分析

PCR扩增阳性产物经GoldMag-PCR产物纯化试剂盒回收和纯化后，送至上海生工武汉分公司测序，测序结果与Genbank中结核分枝杆菌标准菌株H37Rv进行比对。

1.6 北京基因型鉴定

采用RD105基因缺失法［8］鉴别“北京基因型”菌株，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR反应阳性鉴定为“北京基因型”。

2 结果

2.1 rpsL基因测序结果

20株对SM敏感的临床分离株均未检测到rpsL突变，51株SM耐药株中有35株(68.6%)检测到rpsL突变，16株未检测到rpsL突变。35株检测到的rpsL突变主要发生在第43位和第88位密码子，其中30株(58.8%)为Lys 43 Arg AAG→AGG的突变，5株(9.8%)为rpsL 88位突变，rpsL 88位突变包括两种类型:Lys 88 Arg AAG → AGG(7.8%，4/51)和Lys88GluAAG → GAG(2.0%，1/51)(表 1，图1)。

2.2 MICs值分析

71株临床分离株的SM MICs值、rpsL突变结果及北京基因型分布情况见表1。20株SM敏感株rpsL基因未突变，MICs＜0.25 mg/L，51株 SM 耐药株MIC≧1 mg/L，以8 mg/L为主(15株)，最高MIC为＞16 mg/L。

2.3 北京基因型鉴定结果

71株临床分离株中有65株(91.5%)“北京基因型”菌株;6株“非北京基因型”菌株(表1)。这表明在武汉地区流行的结核分枝杆菌主要为“北京基因型”。而在 51株 SM耐药菌株中，有 47株(92.2%)为“北京基因型”菌株，35株 rpsL突变菌株中，有33株(94.3%)为“北京基因型”菌株，这可能跟“北京基因型”菌株较其他菌株有更强的致病性、传播力以及更易发生基因突变为耐药菌株有关［9］。

图1 耐SM临床分离株rpsL基因点突变Lys43Arg AAG→AGG

表1 临床分离株rpsL基因突变情况 (n=71)

2.4 rpsL基因突变与SM耐药水平之间的关系

30株rpsL 43突变株MICs大部分(27株)分布在2 mg/L到 ＞16 mg/L，另有两株 MIC为 0.5 mg/L，一株 MIC为 1 mg/L。5株 rpsL88突变株MICs均大于2 mg/L。SM MIC≦1 mg/L的菌株(低水平耐药株)rpsL突变率为50%(3/6)，SM MIC≧2 mg/L的菌株(高水平耐药株)的rpsL 43位和88位总突变率为71.1%(32/45)。

3 讨论

SM首先与结构正常的细菌核糖体蛋白S12结合，在其介导下，结合细菌核糖体30S亚基上的16S rRNA，干扰氨酰tRNA与30S rRNA的连接，来阻断细菌蛋白质的合成，从而发挥药效［10］。研究表明rpsL突变可能与SM高耐药有关［11］，且多发生于北京基因型菌株［12］。

研究报道，新加坡地区rpsL基因突变率为44.4%［12］;东印度地区 rpsL 基因突变率为 40%［13］;本研究中，rpsL基因突变率为68.6%，明显高于上述地区;与深圳(68.3%)［3］和杭州地区(77.5%)［14］相近，比浙江 (33.3%)高［15］。本研究中 rpsL基因突变类型主要有Lys43Arg(AAG→AGG)、Lys88Arg AAG→AGG，还有一株 Lys88Glu AAG→GAG，与其他地区(新加坡、东印度、深圳、杭州、浙江丽水)有所不同［3，12-14］。综上所述，SM 耐药菌株rpsL基因突变率及突变类型均存在地域差异。

本研究中SM敏感株的rpsL基因未突变MICs＜0.25 mg/L，SM低水平耐药株总突变率(50%(3/6))低于高水平耐药株(71.1%(32/45))，rpsL突变与SM高水平耐药的相关性在本研究中关联度不大(χ2=0.335，P=0.563)，与相关报道有差异［11］，可能与本研究中耐药株数量有限有关，应加大样本含量进一步验证。

本研究中SM耐药株中92.2%(47/51)为“北京基因型”菌株，SM敏感株中90%(18/20)为“北京基因型”菌株，但北京基因型与耐药株关联度不大(χ2=0.000，P=1.000)，可能与本研究的样本量大小有关，需要更多实验验证。在武汉地区流行的结核分枝杆菌主要为“北京基因型”，与“北京基因型”传播力强的相关报道一致［16］，应该加强武汉地区结核预防。

［1］WHO.Global tuberculosis control:WHO report 2012［M］.World Health Organization，2012.

［2］Gidi Pelchovich，Alina Zhuravlev，Uri Gophna.Effect of ribosome-targetingantibioticson streptomycin-resistantMycobacterium mutants in the rpsL gene［J］.International Journal of Antimicrobial Agents ，2013，42(2):129-132.

［3］桂静，王峰，罗道泉，等.深圳地区结核分枝杆菌耐药及广泛耐药分离株的分子特征［J］.中华结合和呼吸杂志，2010，33(4):276-279.

［4］Tudo G，Rey E，Borrell S，et al.Characterization of mutations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the area of Barcelona［J］.JournalofAntimicrobial Chemotherapy 2010.65:2341-2346.

［5］中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程［M］.北京:中国教育文化出版社，2006:49-51.

［6］李宙阳，周英.刃天青显色法检测铜绿假单胞菌对几种抗茵药物的敏感性［J］.山地农业生物学报，2010，29(3):237-241.

［7］张舒林，伍学强，祖燕等.应用PCR-SSCP检测耐异烟肼结核分支杆菌KatG基因突变［J］.中国卫生检验杂志，2000，10(2).

［8］Tsolaki A G.Hrish A E，Deriemer k，et al.Functional and evolutionary genomics of Mycobacterium tuberculosis:Insights from genomic deletions in 100 strains［J］.Proc Natl Acad Sci，2004，101:4865-4870.

［9］Sahal A H，Nalin R.The emergence of Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis in the Kingdom of Saudi Arabia［J］.Annals of Thoracic Medicine，2010，5(3):149-152.

［10］Julian Davies，Walter Gilbert，Luigi Gorini.STREPTOMYCIN， SUPPRESSION， AND THE CODE［J］.Proc Natl Acad Sci U S A.1964，51(5):883-890.

［11］魏淑贞，赵秀芹，刘志广，等.结核分枝杆菌链霉素耐药临床分离株rpsL基因突变特征分析［J］.中国人兽共患病学报，2011，27(12).

［12］Sun Y J，Luo J T，Wong SY et al.Analysis of rpsL and rrs mutations in Beijing and non-Beijing streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Singapore［J］.Clin Microbiol Infect，2010，16(3):287-289.

［13］Potdar，Pravin，Prerna Thakur.Development of Sequence Based Molecular Diagnostic Test to Evaluate MDR and XDR in M.tuberculosis Patients from Western India［J］.American Journal of Infectious Diseases and Microbiology，2013:50-58.

［14］沈国强，王洁，吴盛海，等.杭州地区结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变分析［J］.江苏医药，2013，39(11):1256-1258.

［15］徐威香，雷永良，王晓光，等.丽水市结核分枝杆菌5种耐药基因突变分析［J］.中国卫生检验杂志，2012，22(2):353-356.

［16］Marais B J，Mlambo C K，Rastogi N，et al.Epidemic Spread of Multidrug-Resistant Tuberculosis in Johannesburg，South Africa［J］.Journal of Clinical Microbiology ，2013，51(6):1818-1825.