猪木乃伊胎病原体混合感染的多重PCR诊断

王伟丞，刘志杰，梁海英，曾智勇*，汤德元，刘 钊

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州大学教学实验场，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型感染引起的病毒性疾病，主要与断奶仔猪多系统衰竭综合征等疾病有关，如猪皮炎肾病综合征、猪增生性坏死性肺炎、新生仔猪的先天性震颤、猪呼吸道综合症、肉芽肿性肠炎、母猪繁殖障碍等，这些疾病对猪的生长、发育和死亡有较大影响[1]。乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的一种严重威胁人畜健康的中枢神经系统的急性传染病，猪是JEV最重要的自然增殖动物，发病猪多出现高热，精神沉郁或神经症状，食欲减退，有的出现后肢麻痹、视力减退、摇摆、乱冲撞等症状，同时JEV也是导致猪繁殖障碍的重要病原之一[2]。2013年11月，贵州省都匀市某猪场，共有母猪300头左右，近1个月内，30头初产母猪中有20头出现流产，产死胎、木乃伊胎和弱仔现象，母猪无其他明显症状，该猪场配种前1个月曾免疫PRV、PPV、PRRSV、CSFV和JEV疫苗。为查清猪群发病原因，试验选用猪繁殖障碍性病毒性疫病六重PCR检测方法[3]，对送检的1头木乃伊胎进行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CFSV和JEV感染情况的快速诊断，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料

采集送检木乃伊胎的肺脏、脾脏、淋巴结和脑组织等置于乳钵剪碎后用PBS按1:5倍稀释研磨，制成乳悬液，-80 ℃反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，取上清于 -20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

核酸提取试剂盒；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2.0、DL2000购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒；pMD19-T Simple Vector；普通质粒小提试剂盒为TIANGEN公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成

根 据NCBI公 布PRV gE（NC-006151）、PPV NS1（NC-001718）、PCV2 ORF2 (NC-005148）、PRRSV ORF5 (NC-001961)、CFSV E2（X87939）、JEV E(M55506)序列设计多重PCR引物，预期的扩增目的片段长度为178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp和1 015 bp。

1.4 病料中DNA/RNA的抽提

严格按TaKaRa公司核酸提取试剂盒说明书提取病料中的核酸。

1.5 多重PCR扩增

以病料核酸为模版进行多重PCR扩增。反应体系为50μL， 2×1StepBuffer 25μL， 核 酸 模 版 5μL，PrimeScript one Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1μL，共6对引物，RNase Free H2O 6μL。反应条件：50 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s ，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环 ；72 ℃ 10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。将经胶回收纯化的PCR产物与pMD 19-T Simple载体按常规方法进行连接并转化至Top10感受态细胞。挑取白色菌落进行增菌培养，小剂量试剂盒提取质粒DNA，用质粒PCR进行鉴定，并将阳性克隆质粒送大连宝生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 解剖病理变化

送检的木乃伊胎儿全身肌肉褪色，内脏组织粘连、腐化，脑组织液化。

2.2 多重PCR扩增结果

应用已建立的六重PCR检测技术，对送检的1份病料进行快速检测，扩增出了353 bp和1 015 bp左右大小的特异性条带（图2），扩增的目的条带，经克隆测序，再次证实其分别为PCV2及JEV基因组片段；结果表明，该病死仔猪同时感染有PCV2和JEV两种病毒。

3 讨论

从发病情况、病料剖解及实验室检测，确诊该猪场送检的木乃伊胎病料同时感染有猪圆环病毒2型和猪乙型脑炎病毒。该病例中发生繁殖障碍的均是初产母猪，且母猪本身无明显症状，因此疑似感染有猪细小病毒，但通过实验室检测，未检出PPV，表明仅通过临床症状和病理变化很难对猪场疫情做出确诊，确诊仍需借助实验室诊断。

虽然该猪场的母猪都进行了JEV疫苗的接种，但仍然受到JEV的侵袭，免疫失败的原因可能是该猪场母猪存在JEV的隐性感染，加上猪群中存在PCV2的野毒感染，PCV2可造成猪体免疫抑制，从而使JEV疫苗免疫失败，猪群暴发JEV。据相关研究表明，JEV在贵州地区隐性感染比较严重，感染率达59.97%，其潜在的危害不可忽视，疫苗免疫能够有效防控本病[4]。猪群中感染PCV2 也较为普遍，但真正发病或者表现临床症状的较少，且其疫苗价格较高，出于经济利益考虑，很多养殖户未给猪群免疫PCV2疫苗，但本病例中从木乃伊胎儿检出PCV2，表明该病毒可通过胎盘垂直传播而感染仔猪，但仔猪感染后发病较严重，再与其他病毒或细菌继发或并发感染，可造成仔猪群大量死亡。近年来，猪群多病原体混合感染越发普遍，其中影响最大的就是PRRSV和PCV2的混合感染，因此猪场在做好PRV、PRRSV、CSFV疫苗免疫的同时，需重视对PCV2的防控，猪群接种PCV2疫苗可有效降低发病率和死亡率，在提高饲料报酬和增重、猪群整齐度等方面有明显的效果，因此建议有条件的猪场免疫PCV2疫苗。

PCR方法在疾病诊断上具有操作简便、快速、特异性好、灵敏度高的优点，本试验采用的多重PCR能够同时检测多种病原，利于对疾病做出快速准确的诊断，适合大量临床病料中病原体的快速检测，具有较大的应用价值。

图1 病料解剖病理变化

图2 病料多重PCR扩增产物电泳结果

[1]乔翠，高凤山，许崇波.猪圆环病毒2型分子致病机理及相关疾病研究进展[J].中国畜牧兽医.2012，39(2):170-173.

[2]汤德元，王凤，马萍，等. 乙型脑炎病毒贵州分离株E基因原核表达及其免疫原性的研究[J].畜牧兽医学报. 2012，43(8): 1330-1336.

[3]刘志杰，曾智勇，汤德元，等. 猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用[J].畜牧兽医学报,2012，43(9):1429-1436.

[4]程振涛，陈军义，岳筠，等.贵州省猪乙型脑炎血清流行病学调查[J].中国人兽共患病学报.2011，27(12):1156-1158.